三阴性乳腺癌(TNBC)是一种高度侵袭性的乳腺癌亚型,缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2蛋白表达,这使其对现有的靶向疗法无反应
[1]。TNBC患者的预后较差,复发率高,并且对常规化疗产生耐药性
[2]。因此,开发新型治疗策略,如光动力治疗(PDT)法,显得尤为重要
[3]。PDT法结合光敏剂与特定波长的光照射,可诱导活性氧物质(ROS)的生成,从而实现对肿瘤细胞的精准杀伤
[4]。PDT法的另一个优势在于不会产生耐药性。
白藜芦醇(RES)是一种来源于多种植物的天然多酚类化合物,具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性
[5]。对乳腺癌等多种肿瘤,RES表现出显著的抑制作用,能够干扰癌细胞增殖、诱导其凋亡并阻止其侵袭和转移
[6]。然而,由于RES水溶性差和生物利用度低,临床应用受到限制
[7]。近年来,纳米技术为提高RES的生物利用度提供了新的解决方案。纳米药物递送系统可以提高药物的溶解性、稳定性,并改善药物在体内的靶向分布
[8]。
本研究采用Soluplus纳米颗粒系统作为递送载体,将RES与光敏剂Ce6共同包封,以提高其对 TNBC的治疗效果。Soluplus是一种两亲性聚合物,能够增强难溶性药物的溶解度
[9]。通过将RES和Ce6结合在纳米颗粒中,PDT治疗下可以显著提高药物的抗肿瘤效果,尤其是在抑制细胞迁移和侵袭方面
[10]。相关研究表明,纳米颗粒的应用不仅能改善药物的生物利用度,还通过有效的药物递送系统增强PDT的治疗效果
[11]。
此外,进一步探讨了这种纳米颗粒递送系统对上皮-间质转化(EMT)的调控作用。EMT在肿瘤的侵袭和转移中起着关键作用
[12],RES在被纳米颗粒包封后,通过PDT可以更好地调控EMT相关的信号通路,抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭
[13]。这为未来TNBC的治疗提供了新的思路和实验依据
[14-15]。
1 材料、试剂与仪器
1.1 材料与试剂
白藜芦醇(Resveratrol,RES),购自Sigma-Aldrich;光敏剂Ce6(Chlorin e6)购自Frontier Scientific;载体材料Soluplus,购自BASF公司。
1.2 仪器
R-1005旋转蒸发器,郑州长城科工贸有限公司生产;JY96-IIN超声波粉碎机,东莞洛泰公司生产;e2695-2998高效液相色谱仪,美国Waters公司生产;NanoBrook 90Plus粒度分析仪,美国Brookhaven公司生产;Thermo Nicolet IS5傅里叶变换红外光谱仪,美国Thermo Fisher公司生产;InfiniteF50酶标仪,瑞士Tecan公司生产;CFX96 Touch实时定量PCR仪,伯乐生命医学产品有限公司生产。
1.3 细胞株
乳腺癌细胞株MDA-MB-231,购自北京中生奥邦生物科技有限公司,培养于含10%胎牛血清(FBS)+1%双抗的Leibovitz's L-15培养基,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
2 实验方法
2.1 纳米颗粒的制备
采用薄膜水合法制备Ce6-RES@Soluplus纳米颗粒。Soluplus、Ce6和RES按150∶1∶1的质量比溶解于甲醇中,混匀后在45℃下进行旋转蒸发形成薄膜。加入10 mL磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)溶液,45℃下水合30 min,得到纳米颗粒悬浮液。冰浴条件下对悬浮液进行探头超声,条件为100 W,2 s开、2 s关,超声4 min,使纳米粒均匀分散,完成后于4℃储存。
2.2 纳米颗粒表征
使用Brookhaven光散射粒度分析仪测定纳米颗粒的粒径和多分散性指数(PDI);使用Zetasizer分析仪测定纳米颗粒的Zeta电位;将纳米颗粒悬浮液滴在铜网格上,晾干后在透射电子显微镜下观察其形态;使用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)扫描样品压片,得到红外光谱图;研磨样品成细粉状,装载于样品台上,进行X射线衍射(XRD)测定。
2.3 包封率测定
采用高效液相色谱法(HPLC)测定Ce6和RES的包封率。
在306 nm波长下,以乙腈和水(40∶60,V/V)作为流动相,建立RES的标准曲线。通过Sephadex G-25柱分离出游离药物,对纳米颗粒悬浮液进行收集。加入甲醇,溶解后通过HPLC测定药物的含量,根据标准曲线计算药物的实际包封率,包封率的计算式为:
$\mathrm{包}\mathrm{封}\mathrm{率}\left(\%\right)=(\mathrm{包}\mathrm{封}\mathrm{的}\mathrm{药}\mathrm{物}\mathrm{量}/\mathrm{总}\mathrm{药}\mathrm{物}\mathrm{量})\times 100\%$
2.4 细胞培养及处理
MDA-MB-231细胞培养条件为Leibovitz's L-15培养基+10%胎牛血清(FBS)+1%双抗,放置在37℃、100%空气环境下培养,直至细胞融合度达到70%~80%时进行实验处理。实验组分为对照组、RES组、RES@Soluplus组、Ce6-RES@Soluplus暗背景处理组和Ce6-RES@Soluplus光动力治疗组。
2.5 细胞存活率检测
采用CCK-8法测定细胞存活率。将对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于96孔板中,每孔 9 000个细胞,培养24 h后加入不同浓度的RES、Ce6、Ce6@Soluplus和Ce6-RES@Soluplus,分别在暗背景和光动力(50 mW,光照5 min)条件下进行处理。孵育12 h后,加入10 μL CCK-8试剂,继续孵育90 min,使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光值,计算细胞存活率。
2.6 细胞迁移实验
通过划痕实验评估不同药物处理对细胞迁移能力的影响。将对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于6孔板,培养至细胞融合率达95%时,用200 μL移液器吸头在细胞层上划痕。各实验组加入不同药物处理,在0 h和12 h拍照记录划痕愈合情况。使用ImageJ软件计算划痕区域的愈合宽度、细胞迁移率。Transwell实验中,将2.5×105/mL的细胞接种于Transwell小室的上腔,处理后孵育24 h,收集穿过小室的细胞,进行结晶紫染色,用光学显微镜观察并统计细胞穿透率。
2.7 Western Blot检测
Western Blot分析EMT相关蛋白的表达水平。提取各组细胞总蛋白,使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE将蛋白样品分离,并转移至PVDF膜,分别使用相应一抗和HRP标记的二抗进行孵育。加入ECL发光底物,使用化学发光成像系统检测条带信号。相对蛋白表达量通过图像分析软件进行定量,以β-Actin作为内参。
3 结果与分析
3.1 粒径、多分散指数与电位
Ce6-RES@Soluplus纳米颗粒悬浮液经稀释超声混匀后置于电位杯中,测试粒径及Zeta电位。测得粒径为(71.9±2.0) nm,大多集中在60~80 nm之间,具有良好均匀性。Zeta电位为(1.48±0.12) mV,表面电荷较低,在水性介质中能稳定存在。经计算得到Ce6和RES的包封率分别为83.74%和80.12%。综合数据显示Ce6-RES@Soluplus纳米颗粒的稳定性良好,适用于药物递送。
在第0、1、2、4、10 d和30 d,颗粒尺寸保持稳定。PDI值为0.106,整个实验期间颗粒的分散性和均匀性较好,见
图1、
图2。结果表明,Ce6-RES@Soluplus纳米颗粒在长时间内具备良好的结构完整性,为后续药物递送提供可靠保障。
3.2 红外光谱分析
对RES、Ce6、@Soluplus和Ce6-RES@Soluplus纳米颗粒进行FT-IR分析,如
图3。由
图3可知,在Ce6-RES@Soluplus纳米颗粒中,原RES的羟基特征峰发生偏移,C
O吸收峰有所变化,证明RES已成功负载于纳米颗粒中。同时Ce6吸收峰的改变验证了其被成功包封于纳米颗粒中。分析可知,所制备的Ce6-RES@Soluplus纳米颗粒显著改变了药物分子结构,提高了水溶性和生物利用度。
3.3 X射线衍射分析
在Ce6-RES@Soluplus纳米颗粒中,属于RES和Ce6的典型结晶性衍射峰显著减弱甚至消失,证明RES和Ce6的结构从结晶态转变为无定形态,见
图4。无定形态有助于提高药物的溶解性和生物利用度,XRD结果进一步证实了药物在Soluplus纳米颗粒中的成功包封效果。
3.4 暗背景细胞毒性实验
在暗背景条件下,投药浓度为2 μg/mL时,RES和RES@Soluplus组细胞存活率略低于对照组,分别为89.75%±3.24%和87.46%±3.18%。浓度为 6 μg/mL时,Ce6-RES@Soluplus组存活率显著低于Ce6组,为72.38%±0.81%,(
P<0.05),见
图5。结果表明,在无光激活下,Ce6-RES@Soluplus的毒性较低,保证了其在暗背景下的安全性,为Ce6-RES@Soluplus的光动力治疗应用提供了基础安全性数据。
3.5 PDT对细胞存活率的影响
在光动力治疗条件下不同药物及不同浓度对MDA-MB-231细胞存活率的影响见
图6。在投药浓度为4 μg/mL时,Ce6-RES@Soluplus组相较于Ce6组、Ce6@Soluplus组的细胞存活率显著降低至43.67%±2.15%(
P<0.01)。在最高浓度8 μg/mL下,Ce6-RES@Soluplus组细胞存活率进一步下降至30.47%±1.62%,有显著的细胞抑制效果。表明Ce6-RES@Soluplus在PDT激活条件下对细胞具有显著杀伤效果,验证了Ce6-RES@Soluplus在PDT治疗中对TNBC细胞的抗肿瘤潜力。
不同药物处理后细胞形态发生显著变化,结果见
图7。对照组细胞形态正常,24 h和48 h内细胞呈典型的纺锤状,分布均匀。RES组和RES@Soluplus组在48 h后部分细胞开始收缩,而Ce6-RES@Soluplus光动力治疗组在24 h即观察到细胞变圆,细胞间隙增加,48 h几乎所有细胞表现为圆形,且细胞数量明显减少。表明Ce6-RES@Soluplus在PDT激活下显著影响细胞形态,推测其对细胞生长的抑制及凋亡效应显著增强。
3.6 细胞划痕实验
细胞划痕实验结果如
图8(a)。对照组细胞愈合率为62.15%±5.43%,细胞有较强的迁移能力;RES组的细胞愈合率为20.36%±3.29%;RES@Soluplus组为23.15%±3.56%。在PDT条件下Ce6-RES@Soluplus组细胞愈合率显著降低至7.07%±1.05%,相比对照组降低了88%(
P<0.001),对细胞迁移具有显著的抑制效果。
Transwell实验结果见
图8(b),对照组侵袭细胞数量高达293±13个,RES组侵袭细胞数降至178±9个,RES@Soluplus进一步降低至131±7个。Ce6-RES@Soluplus光动力治疗组中,细胞穿过小室的数量减少至6±2个,侵袭率几乎降至0%,相比对照组显著降低了98%(
P<0.001)。
结果表明,Ce6-RES@Soluplus在PDT激活下显著抑制了TNBC细胞的迁移侵袭能力。
3.7 EMT相关蛋白表达的Western Blot分析
对照组中,MMP-9、MMP-2、VIM和VEGF的相对表达量均接近1.0。RES组和RES@Soluplus组MMP-9、MMP-2、VEGF的表达量略显降低,Ce6-RES@Soluplus光动力治疗组的4种蛋白表达量与对照组相比显著降低(
P<0.001),见
图9。数据表明,Ce6-RES@Soluplus纳米颗粒结合PDT显著抑制了EMT相关蛋白的表达,从而有效阻止TNBC细胞的迁移与侵袭。
以上实验及数据分析表明,Ce6-RES@Soluplus纳米颗粒在PDT条件下表现出显著的细胞毒性、形态变化、迁移和侵袭抑制能力,并通过下调MMP-9、MMP-2、VIM和VEGF等蛋白表达有效阻断了 TNBC细胞的EMT过程。该研究为Ce6-RES@Soluplus结合PDT治疗在TNBC中的抗肿瘤应用提供了有力的实验支持和分子机制解释。
4 结论
通过薄膜水合法成功制备了包载RES和Ce6的Soluplus纳米颗粒,粒径为(71.9±2.0) nm,Zeta电位为(1.48±0.12) mV,PDI为0.106,Ce6和RES的包封率分别为83.74%和80.12%,较小的粒径使其具有渗透到肿瘤微环境中并长期滞留的能力。Soluplus纳米颗粒载体系统不仅提高了Ce6和RES的溶解性,还增加了药物的体内稳定性,避免药物在生理环境中快速降解。此外,通过包载Ce6,进一步增强Soluplus纳米颗粒载体系统的光敏性和生物利用度,降低系统毒性的同时,具有显著的靶向效应。
Western Blot分析显示,Ce6-RES@Soluplus纳米颗粒在PDT条件下显著抑制了EMT相关蛋白(如MMP-9、MMP-2、VIM、VEGF)的表达,从而有效阻止了TNBC细胞的迁移和侵袭。表明纳米颗粒负载系统在调控肿瘤细胞的转移能力方面具有显著作用,能够有效阻止肿瘤细胞侵袭到周围组织的能力
[16]。
此外,PDT对EMT过程的抑制效果显著。研究表明,EMT在肿瘤转移过程中起到关键作用,通过调控EMT相关通路,可以有效抑制肿瘤的迁移能力
[17]。Ce6-RES@Soluplus纳米颗粒通过PDT激活,显著降低了VEGF的表达,从而减少了肿瘤血管生成。该抑制效果不仅限制了肿瘤细胞的迁移能力,也抑制了血管生成,从而减少了肿瘤对营养的需求并降低了转移扩散的可能性。
未来可以进一步优化Soluplus纳米颗粒系统,探索如何改善PDT的光敏效率,并通过调整纳米颗粒的粒径、表面电荷等因素以优化其在体内的靶向性和穿透力。此类优化不仅可能提升治疗效果,也可以减少药物的全身性副作用。本研究结果表明,纳米颗粒结合PDT为TNBC提供了具有潜力的治疗选择,但在正式进入临床应用之前,还需进一步的体内研究和长期疗效评估。
PDF
(8804KB)
