现代化工

现代化工 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (S2) : 373-376. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.S2.062

分析测试

缺磷条件下玉米根系分泌有机酸的高效液相色谱测定方法研究

谢旭 ¹^,² ,
李明亮 ¹^,² ,
张帆 ¹^,² ,
卢兵 ¹^,² ,
杨园 ¹^,²^,^* ,
赵文志 ¹^,²

作者信息 +

Determination of organic acids secreted by maize roots under phosphorus deficiency by high-performance liquid chromatography

XIE Xu ¹^,² ,
LI Ming-liang ¹^,² ,
ZHANG Fan ¹^,² ,
LU Bing ¹^,² ,
YANG Yuan ¹^,²^,^* ,
ZHAO Wen-zhi ¹^,²

Author information +

文章历史 +

Received		Published
2026-04-17		2026-10-31
Issue Date	Revised Date
2026-10-21	2026-04-17

PDF (1549K)

摘要

建立缺磷条件下玉米根系分泌有机酸的高效液相色谱测定方法,通过对色谱条件进行优化,实现对酒石酸、柠檬酸、苹果酸、丁二酸和反丁烯二酸的定量分析。结果表明,5种有机酸分离效果良好,线性相关系数R²>0.999,方法检出限为 0.01~0.90 μg/mL,定量限为0.15~5.00 μg/mL,相对标准偏差(RSD)为2.48%~3.77%,回收率为89.0%~118.7%。该方法简便、灵敏、重现性好,适用于缺磷条件下玉米根系分泌有机酸的批量定量分析。

Abstract

A high-performance liquid chromatography (HPLC) method was established for the determination of organic acids secreted by maize roots under phosphorus-deficient conditions.By optimizing the chromatographic conditions,quantitative analysis of tartaric acid,citric acid,malic acid,succinic acid,and fumaric acid was achieved.The results showed good separation of the five organic acids,with linear correlation coefficients R²>0.999.The limits of detection (LOD) ranged from 0.01 to 0.90 μg/mL,and the limits of quantification (LOQ) ranged from 0.15 to 5.00 μg/mL.The relative standard deviations (RSD) were 2.48%-3.77%,and the recoveries ranged from 89.0% to 118.7%.The method is simple,sensitive,and reproducible,making it suitable for the batch quantitative analysis of organic acids secreted by maize roots under phosphorus-deficient conditions.

Graphical abstract

关键词

高效液相色谱法 / 玉米根系 / 有机酸 / 缺磷胁迫 / 分泌

Key words

high-performance liquid chromatography / maize roots / organic acids / phosphorus deficiency stress / secretion

引用本文

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谢旭,李明亮,张帆,卢兵,杨园,赵文志. 缺磷条件下玉米根系分泌有机酸的高效液相色谱测定方法研究[J]. 现代化工, 2026, 46(S2): 373-376 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.S2.062

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磷(P)是植物生长发育所必需的大量营养元素之一,是植物体内许多代谢物和大分子物质(例如核酸、磷脂、蛋白质等)的重要组分,对作物生长发育、抗逆性、产量和品质形成起着重要作用^[1]。合理施用磷肥是保障土壤磷供应与作物高产稳产的重要措施^[2]。但我国耕地磷肥当季利用率仅10%~25%,大量磷素被土壤固定成为潜在磷源^[3-4]。提高作物自身磷利用效率、活化土壤难溶性磷已成为研究重点。低磷胁迫下,植物可通过根系形态重塑、生理代谢调节及分泌物释放等策略活化土壤难溶性磷,其中根系分泌有机酸是提升磷吸收效率的核心机制^[5-8]。

目前有机酸检测以滴定法和高效液相色谱法为主,滴定法仅能测定总酸含量,无法实现单体有机酸区分^[9]。高效液相色谱法因灵敏度高、分离效果好、可多组分同步定量,已成为主流检测技术^[10]。张彩红等^[11]、朱敏等^[12]、马倩倩等^[13]分别建立了果实、茶叶等农产品中有机酸的HPLC检测方法;刘小莉等^[14]、王丽丽等^[15]进一步优化了水溶性有机酸的分离条件。但这些方法普遍存在前处理复杂、提取效率不稳定等问题,且多针对食品基质,对低浓度、易降解、基质复杂的玉米根系分泌物适用性较差,针对缺磷胁迫下玉米根系有机酸的专属提取体系与色谱条件优化研究较少,难以满足精准、批量检测需求。

本文中以缺磷条件下玉米根系分泌物为研究对象,系统优化色谱条件(检测波长、流速、流动相组成及梯度洗脱程序),建立一种简便、灵敏、重现性好的高效液相色谱方法,为玉米低磷适应机制解析与磷高效利用研究提供技术支撑。

1 材料与试剂

LC-2040C高效液相色谱仪器,日本岛津仪器公司;TG-16湖南湘仪离心机仪器有限公司;R-300旋转蒸发仪,瑞士步琦仪器设备有限公司。

酒石酸、柠檬酸、苹果酸、丁二酸和反丁烯二酸5种有机酸溶液,氯化钙、草酸、甲醇、磷酸二氢钾。

2 实验方法

2.1 植物培养与低磷处理

采用水培法培养玉米幼苗。选取饱满一致的玉米种子,经表面消毒后播种于石英砂中,待幼苗长至2叶1心时,移栽至含有1/2 Hoagland营养液的培养盆中。正常培养7 d后,将植株转移至低磷营养液(磷浓度为5 μmol/L)中进行缺磷胁迫处理,以正常磷浓度(500 μmol/L)培养植株作为对照。

2.2 根系分泌物的收集

缺磷处理14 d后,采用溶液收集法采集根系分泌物。用自来水轻轻冲洗,再用蒸馏水漂洗3次,尽量减少对根系的机械损伤。将洗净的根系转移至装有200 mL 0.005 mol/L CaCl₂溶液的收集瓶中,于光照条件下通风培养2 h。收集液在40℃下旋转蒸发浓缩至约10 mL,经0.45 μm水相滤膜过滤后,于-20℃保存待测。

3 结果与分析

3.1 色谱条件的优化

3.1.1 色谱柱的选择

本研究选用InertSustain C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)作为分离柱。C18反相柱是高效液相色谱中应用最广泛的固定相,在低pH流动相(0.1%磷酸)条件下,有机酸羧基质子化后疏水性增强,可获得良好的保留与分离效果,且便于与已有文献[11 -15]中采用C18柱的研究结果进行横向比较。与伍婵翠等^[16]采用XSelect HSS T3柱(专为极性化合物设计)的方法相比,本研究所用C18柱配合梯度洗脱程序,实现5种有机酸的基线分离(分离度>1.5),且柱压更低、运行成本更经济,同时避免了T3柱在梯度洗脱过程中基线漂移明显的缺陷。250 mm柱长提供了足够的理论塔板数,能够有效分离结构相近的苹果酸和柠檬酸;5 μm粒径在分离效率与柱压之间取得了合理平衡,兼顾了方法的普适性与推广价值。需要指出的是,本研究未考察氨基柱或离子交换柱等其他类型色谱柱的分离效果,后续研究可采用混合模式色谱柱(如反相/离子交换混合柱)以期实现更多种类有机酸的同时分离。

3.1.2 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对190~300 nm波长范围进行扫描,结果显示5种目标有机酸的紫外吸收峰主要分布于200~230 nm区间。在210 nm波长处,样品基质中其他组分的干扰较小,各有机酸响应良好。该波长选择与刘小莉等^[14]、王丽丽等^[15]的报道一致,也与国家标准GB 5009.157—2016推荐的有机酸通用检测波长相吻合^[10]。值得注意的是,210 nm作为有机酸测定的常用波长,可在保证检测灵敏度的前提下简化多组分同时测定的操作流程。因此,本研究确定210 nm为最佳检测波长。

3.1.3 流动相流速的确定

流速是影响色谱分离效率与分析时间的重要参数。本文中考察了0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 4种流速条件下有机酸的分离情况。结果如表1所示,流速为0.6 mL/min时,色谱峰形展宽明显,出现拖尾现象,分离效率较低;当流速升至1.0 mL/min及以上时,组分间分离度下降,部分有机酸无法实现基线分离。相比之下,0.8 mL/min流速下各有机酸峰形对称、分离度理想(分离度均大于1.5),且分析周期适中。综合考虑分离效率与分析时间,确定最佳流速为0.8 mL/min。

3.1.4 流动相比例选择

由于有机酸极性较强,在纯水相中溶解度有限,等度洗脱难以实现多种有机酸的同时高效分离。本文中采用梯度洗脱程序,以0.1%磷酸水溶液为流动相A、甲醇为流动相B进行优化。结果表明,在 0~10 min维持A相97.5%、B相2.5%的条件下,酒石酸、苹果酸、柠檬酸可实现基线分离;随后在 10.1~16 min切换至B相100%以洗脱强保留组分(丁二酸和反丁烯二酸);最后于16.1~21 min恢复初始比例并平衡色谱柱。如图1所示,该梯度程序下,5种有机酸在21 min内实现完全分离,分离度均大于1.5,峰形对称,重复性好。

3.2 线性关系与灵敏度

在优化的色谱条件下,对系列浓度的混合标准溶液进行测定,以峰面积(y)对质量浓度(x,μg/mL)进行线性回归。结果如表2所示,5种有机酸在各自的线性范围内呈良好的线性关系,相关系数R²均大于0.999。以3倍信噪比(S/N=3)计算检出限(LOD),以10倍信噪比(S/N=10)计算定量限(LOQ)。5种有机酸的LOD为0.01~0.90 μg/mL,LOQ为0.15~5.00 μg/mL,表明该方法具有较高的灵敏度,可满足玉米根系分泌物中有机酸的检测需求。

3.3 精密度与回收率

3.3.1 精密度

取同一缺磷处理的玉米根系分泌物样品,按本方法平行处理6份,在优化色谱条件下进行测定。结果如表3所示,5种有机酸的相对标准偏差(RSD)为2.48%~3.77%,表明该方法具有良好的重复性和精密度。

3.3.2 回收率试验

采用加标回收法评价方法的准确度。取已知含量的根系分泌物样品,分别添加低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液,按本方法进行处理和测定。结果表明,5种有机酸的平均加标回收率为89.0%~118.7%(表4),RSD均小于5%,满足定量分析要求。

3.4 实际样品分析

为验证本方法在真实科研场景与实际样品中的适用性与可靠性,对6份平行玉米根系分泌物样品进行测定,结果如表5所示,酒石酸、苹果酸、柠檬酸均可稳定检出,丁二酸和反丁烯二酸含量均低于定量限(<LOQ)。总有机酸含量为1 332.0 mg/kg,其中苹果酸为优势组分,含量达875.0±45.6 mg/kg,占总有机酸65.7%;柠檬酸次之,含量444.0±28.3 mg/kg,占比33.3%;酒石酸含量最低,为13.0±1.2 mg/kg,仅占1.0%。3种检出有机酸检出率均为100%,数据稳定性良好。表明在批量实际样品测定中,数据重复性好、结果可靠。

4 结论

本研究针对缺磷条件下玉米根系分泌物基质复杂、有机酸含量低的特点,建立一种高效液相色谱测定方法。通过系统优化色谱条件,确定210 nm为最佳检测波长,采用磷酸水溶液-甲醇体系结合梯度洗脱程序,在流速0.8 mL/min下实现了酒石酸、柠檬酸、苹果酸、丁二酸和反丁烯二酸5种有机酸在21 min内的基线分离。方法学验证表明,各有机酸线性相关系数R²均大于0.999,检出限为0.01~0.90 μg/mL,定量限为0.15~5.00 μg/mL;精密度试验相对标准偏差(RSD)为2.48%~3.77%,加标回收率为89.0%~118.7%,结果表明该方法线性关系良好、灵敏度高、准确可靠。通过实际样品验证,本方法操作简便,无需复杂衍生化或萃取步骤,分离效果好,分析周期适中,适用于缺磷条件下玉米根系分泌有机酸的批量定量分析,可为玉米低磷适应机制研究提供技术支撑。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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