现代化工

现代化工 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (S2) : 79-85. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.S2.015

科研与开发

人工菌群Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8协同降解苯酚和吲哚的性能优化研究

原凯毅 ¹^,² ,
端允 ¹ ,
袁进 ¹^,² ,
范晓军 ¹^,²^,^*

作者信息 +

Performance optimization of phenol and indole co-degradation by the synthetic microbial consortium Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8

YUAN Kai-yi ¹^,² ,
DUAN Yun ¹ ,
YUAN Jin ¹^,² ,
FAN Xiao-jun ¹^,²^,^*

Author information +

文章历史 +

Received		Published
2026-04-17		2026-10-31
Issue Date	Revised Date
2026-10-21	2026-04-17

PDF (3719K)

摘要

以从焦化厂活性污泥中分离获得的3株功能菌Kl-TY2、Kl-TY6和Kl-TY8为研究对象,经分子生物学鉴定,3株菌均为克雷伯氏菌属,结合近缘菌株功能注释信息可推测,3株菌在苯酚与吲哚降解过程中可能存在一定代谢互补。2³全因子设计结果表明,菌株组合Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8在72 h内对苯酚和吲哚的降解率均超过90%,综合降解性能优于单菌及双菌体系。进一步通过单因素试验和响应面法优化降解条件,确定温度、pH和苯酚初始浓度为主要影响因子,预测最优条件约为31.7℃、pH 7.03、苯酚507.4 mg/L,实测苯酚降解率达91.78%。结果表明,人工菌群Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8具有较强的苯酚-吲哚协同降解能力,可为焦化废水生物处理工艺优化提供参考。

Abstract

This study was conducted using three functional strains,Kl-TY2,Kl-TY6,and Kl-TY8,which were isolated from activated sludge collected from a coking plant.Based on molecular biological identification,all three strains belong to the genus Klebsiella.Taking into account functional annotation information from closely related strains,it is hypothesized that the three strains may exhibit metabolic complementarity during the degradation of phenol and indole.The results of a 2³full-factorial design showed that the consortium Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8 achieved degradation rates of both phenol and indole exceeding 90% within 72 h,and its overall degradation performance was superior to those of single-strain and dual-strain systems.Furthermore,single-factor experiments and response surface methodology were employed to optimize the degradation conditions,and temperature,pH,and the initial phenol concentration were identified as the primary influencing factors.The predicted optimal conditions were approximately 31.7℃,pH 7.03,and an initial phenol concentration of 507.4 mg/L;under these conditions,the experimentally observed phenol degradation rate reached 91.78%.These results indicate that the synthetic microbial consortium Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8 possesses strong synergistic capabilities for phenol-indole co-degradation,providing a reference for optimizing biological treatment processes for coking wastewater.

Graphical abstract

关键词

苯酚 / 吲哚 / 人工菌群 / 响应面法 / 生物降解

Key words

phenol / indole / synthetic microbial consortium / response surface method / biodegradation

引用本文

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原凯毅,端允,袁进,范晓军. 人工菌群Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8协同降解苯酚和吲哚的性能优化研究[J]. 现代化工, 2026, 46(S2): 79-85 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.S2.015

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焦化废水是一类典型的高浓度、成分复杂且生物毒性较强的工业废水^[1],其中苯酚和吲哚是较具代表性的两类污染物^[2]。苯酚属于常见酚类有机物,浓度较高时会对微生物生长和代谢产生明显抑制^[3];吲哚则属于含氮杂环芳香族化合物,结构相对稳定,在废水处理中同样具有较高去除难度^[4]。由于二者在焦化废水中常常共存,其复合污染特征会进一步增加生物处理过程的复杂性^[5]。

近年来,针对焦化废水中典型芳香族污染物的去除,生物处理因其成本低、环境友好,已成为焦化废水处理中必不可少的选择方法^[6]。目前,Pseudomonas^[7]、Acinetobacter^[8]及Bacillus^[9]等被认为是降解苯酚的主要菌属,Comamonas^[10]、Bacillus^[11]、Acinetobacter^[12]等菌属在吲哚降解中表现出一定能力,但降解效率普遍低于苯酚,且对底物浓度敏感。同时,人工菌群构建逐渐成为研究热点^[13-14],通过不同菌株间的功能分工与代谢互补,有望提高复杂污染物体系的降解效率和环境适应性^[15]。

尽管如此,现有研究仍存在一些不足。一方面,关于苯酚与吲哚共存条件下协同生物降解的研究相对较少,尤其缺乏针对人工菌群构建、菌株组合筛选及关键影响因素优化的系统研究^[16];另一方面,复合底物条件下菌株间可能存在的代谢协同关系及其对体系稳定性的影响仍有待进一步明确^[17]。因此,有必要从实际污染背景出发,筛选适用于苯酚-吲哚体系的功能菌株,并建立具有协同降解潜力的人工菌群。

基于此,本研究以焦化厂活性污泥中分离获得的功能菌株为对象,围绕苯酚和吲哚复合污染体系开展研究。通过菌株鉴定与组合筛选确定优势人工菌群,进一步考察环境因子对其降解性能的影响,并采用响应面法对关键条件进行优化,同时结合近缘菌株信息对其潜在协同降解机制进行初步分析。该研究可为焦化废水中典型含氮芳香族污染物的生物处理及人工菌群强化应用提供理论依据和参考。

1 材料与试剂

1.1 样品与菌株

本研究所用水样及污泥来源于山西太原市某焦化废水处理厂,用于前期功能菌株的分离与保存。所用菌株为课题组前期工作中从该活性污泥中筛选获得的人工菌群Kl-TY2、Kl-TY6和Kl-TY8,菌株保藏于-80℃冰箱中。

1.2 培养基及试剂

富集培养基(LB):胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L,pH 7.0±0.2。

无机盐培养基(MSM):(NH₄)₂SO₄ 0.472 g/L,K₂HPO₄ 0.200 g/L,MgSO₄·7H₂O 0.050 g/L,MnSO₄·4H₂O 0.010 g/L,FeSO₄ 0.010 g/L,NaCl 0.120 g/L,pH 7.0±0.2。

磷酸盐缓冲溶液(PBS):NaCl 8.0 g/L,KCl 0.2 g/L,KH₂PO₄ 0.24 g/L,Na₂HPO₄ 1.44 g/L,pH 7.0±0.2。

5 g苯酚溶于100 mL超纯水制成苯酚储备液,50 g吲哚溶于100 mL甲醇制成吲哚储备液,将储备液添加至MSM中提供碳源。

固体培养基在上述培养基的基础上添加2%的琼脂。所有培养基在使用前都需要在121℃的高压下湿热灭菌30 min,冷却至室温后再进行后续实验。

2 实验方法

2.1 菌株分子生物学鉴定

将保藏的菌株Kl-TY2、Kl-TY6和Kl-TY8复苏扩培待培养到对数期后,取适量菌液,在4℃下,以8 000 r/min离心10分钟收集菌体沉淀,委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行16S rDNA测序,并将测序结果提交至NCBI数据库进行BLAST比对,利用MEGA 11.0软件构建系统发育树。

2.2 基于近缘菌株信息的代谢通路推测

根据菌株16S rDNA鉴定结果,结合NCBI数据库中近缘菌株的公开注释信息,对Kl-TY2、Kl-TY6和Kl-TY8可能参与的苯酚与吲哚降解过程进行初步分析。重点参考近缘菌株在芳香族化合物氧化、开环裂解及下游代谢方面的相关信息,并结合苯酚、吲哚的常见生物降解途径,对人工菌群Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8的潜在协同降解过程进行推测,据此绘制代谢通路示意图。

2.3 人工菌群全因子实验

为系统比较菌株Kl-TY2、Kl-TY6和Kl-TY8在苯酚-吲哚体系中的单独及协同降解能力,以三株菌是否接种为自变量,采用2³全因子设计构建不同组合。共得到8种组合:3个单菌体系(Kl-TY2、Kl-TY6、Kl-TY8)、3个双菌体系(Kl-TY2+Kl-TY6、Kl-TY2+Kl-TY8、Kl-TY6+Kl-TY8)、1个三菌体系(Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8)以及1个空白对照(不接种)。各组合接种至含500 mg/L苯酚和200 mg/L吲哚的MSM中,在30℃、150 r/min条件下振荡培养72 h,分别取0 h和72 h样品测定苯酚及吲哚浓度,计算降解率。

2.4 单因素实验

采用单因素实验对影响人工菌群协同降解效果的主要因素进行考察。结合前期实验结果及相关研究基础,选取温度、pH、苯酚初始浓度、吲哚初始浓度、接种量以及接种比例作为考察因素。各因素梯度分别设置为:温度20、25、30、35、40℃;pH=4、5、6、7、8、9和10;苯酚初始浓度300、400、500、600、700 mg/L;吲哚初始浓度100、150、200、250、300 mg/L;接种量1%、3%、5%、7%、9%;菌株Kl-TY2、Kl-TY6和Kl-TY8的接种比例为1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2、2∶2∶1、2∶1∶2和1∶2∶2。

2.5 响应面优化设计

在单因素实验基础上,因温度、pH和苯酚初始浓度对人工菌群Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8的降解性能影响较为显著,选取上述3个因素作为响应面优化变量。由于人工菌群对吲哚的降解效果较好且波动较小,而苯酚降解更易受环境条件影响,是限制复合体系处理效果的关键因素,故本研究以苯酚降解率作为响应值进行响应面优化。

基于Box-Behnken设计(BBD)框架,采用三因素三水平(-1,0,+1)响应面法系统优化菌株组合Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8的苯酚降解条件^[18-19]。自变量包括:温度(25、30、35℃)、pH(5、7、9)和苯酚初始浓度(400、500、600 mg/L),通过Design-Expert 13软件生成17组实验矩阵(含5个中心点重复),实验设计矩阵及水平编码见表1。

2.6 分析方法

苯酚的高效液相色谱分析条件如下:流动相为乙腈∶水,体积比为60∶40,总流速为1 mL/min^[20]。紫外波长为280 nm。

吲哚的高效液相色谱分析条件如下:流动相为乙腈∶水,体积比为80∶20,总流速为1 mL/min。紫外波长为270 nm。

苯酚和吲哚的去除效果以降解率表示,按式(1)计算。

(1)$R=\left[\left(C_{0}-C_{n}\right) / C_{0}\right] \times 100 \%$

式中,R为污染物去除率,%;C₀和C_n为污染物初始浓度和中间浓度,mg/L。

菌体浓度采用全波长酶标仪测定菌悬液在600 nm处的吸光度(OD₆₀₀)来表征。

3 结果与分析

3.1 菌株鉴定结果

将各菌株的16S rDNA序列,通过NCBI进行Blast比对,菌株Kl-TY2、Kl-TY6和Kl-TY8均与克雷伯氏菌属(Klebsiella)的16S rDNA序列相似性达98%以上,采用MEGA 11.0软件构建各菌株的系统发育树如图1所示。菌株Kl-TY2序列与Klebsiella pneumoniae相似度最高,因此鉴定为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),菌株Kl-TY6和Kl-TY8序列均与Klebsiella pasteurii相似度最高,鉴定为巴斯德克雷伯氏菌(Klebsiella pasteurii)。

3.2 人工菌群苯酚-吲哚协同降解潜在代谢通路推测

根据16S rDNA鉴定结果,Kl-TY2、Kl-TY6和Kl-TY8均与克雷伯氏菌属近缘菌株具有较高相似性,其中Kl-TY2与肺炎克雷伯氏菌近缘,Kl-TY6和Kl-TY8与巴斯德克雷伯氏菌近缘。结合NCBI数据库中近缘菌株的公开注释信息,并参考苯酚和吲哚常见生物降解途径,可推测这3株菌均具备一定的芳香族化合物转化能力。

由图2可知,苯酚可能先转化为儿茶酚,再经开环反应生成开环中间产物;吲哚则可能先转化为芳香族中间体,随后进入开环裂解途径,最终生成小分子有机酸并进入TCA循环。说明人工菌群Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8可能通过共享芳香族化合物降解主通路并形成一定代谢互补,实现对苯酚和吲哚的协同降解。

3.3 全因子实验结果

人工菌群全因子实验结果如表2所示。

由表2可知,各组合均能在72 h内对苯酚和吲哚产生明显去除效果,而空白对照组苯酚和吲哚降解率仅为3.06%±1.05%和1.23%±0.13%,基本无生物降解发生。单菌体系中,Kl-TY2、Kl-TY6和 Kl-TY8对苯酚的72 h降解率分别为78.16%±1.12%、81.76%±1.85%和85.28%±0.89%,对吲哚的降解率则均在96%~98%左右。双菌组合Kl-TY2+Kl-TY6、Kl-TY2+Kl-TY8和Kl-TY6+Kl-TY8在苯酚降解方面整体优于或接近单菌,其中Kl-TY6+Kl-TY8苯酚降解率达到88.61%±1.32%。三菌组合Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8综合表现最佳,72 h苯酚和吲哚降解率分别为91.56%±1.05%和98.09±0.16%,明显高于单菌及大部分双菌组合,显示出一定的协同降解效应。

3.4 单因素实验结果

3.4.1 温度和pH

由图3(a)可知,温度对人工菌群降解苯酚和吲哚的能力影响显著。随着温度由20℃升高至30℃,苯酚降解率由9.17%显著提高至90.16%,吲哚降解率也由87.89%提高至97.69%,同时OD₆₀₀由0.105升高至0.302,表明适宜升温有利于菌群生长及降解酶活性的发挥。当温度进一步升高至35℃时,苯酚降解率略降至83.06%,40℃时苯酚和吲哚降解率分别仅为2.68%和6.62%,OD₆₀₀也降至0.058,说明过高温度对菌群活性具有明显抑制作用。因此,30℃可作为较适宜的培养温度。

由图3(b)可知,pH对人工菌群降解性能也具有一定影响。在pH 4~7范围内,苯酚降解率整体维持在较高水平,并在pH 7时达到最大值89.87%,对应OD₆₀₀也达到最高值0.315,说明中性条件更有利于人工菌群生长及苯酚降解。相比之下,吲哚在不同pH条件下均保持较高降解率,整体波动较小,说明人工菌群对吲哚降解的pH适应范围相对较宽。当pH升高至9和10时,苯酚降解率分别下降至74.82%和16.92%,表明偏碱环境会明显削弱菌群对苯酚的去除能力。因此,后续实验选取pH 7作为适宜条件。

3.4.2 苯酚浓度吲哚浓度

由图4(a)可知,苯酚初始浓度对人工菌群降解性能具有较明显影响。在300~500 mg/L范围内,苯酚降解率分别为88.03%、86.06%和89.50%,变化不大,说明菌群在该浓度范围内具有较好的适应性;当苯酚浓度升高至600 mg/L和700 mg/L时,苯酚降解率分别下降至79.87%和65.95%,同时OD₆₀₀也由0.300下降至0.288和0.187,说明过高苯酚浓度会因毒性增强而抑制菌群生长及降解活性。与此同时,吲哚降解率在各苯酚浓度下均保持在97.6%以上,表明苯酚浓度变化对吲哚去除影响较小。综合考虑,500 mg/L可作为后续实验中较适宜的苯酚初始浓度。

由图4(b)可知,吲哚初始浓度对人工菌群降解性能亦有一定影响。在100~200 mg/L范围内,苯酚降解率分别为91.26%、89.94%和90.68%,吲哚降解率均保持在97.69%以上,OD₆₀₀也维持在较高水平,说明人工菌群在该浓度范围内具有良好的降解能力和适应性。当吲哚浓度升高至250 mg/L时,苯酚降解率下降至75.83%;继续升高至300 mg/L时,苯酚降解率进一步降至22.17%,OD₆₀₀也下降至0.194,表明高浓度吲哚会显著抑制人工菌群活性及苯酚降解过程。相比之下,吲哚自身降解率在各浓度条件下仍维持较高水平。综合考虑,200 mg/L可作为较适宜的吲哚初始浓度。

3.4.3 接种量和接种比例

由图5(a)可知,接种量对人工菌群降解效果具有显著影响。当接种量由1%提高至7%时,苯酚降解率由5.87%显著提高至91.74%,吲哚降解率由3.75%提高至97.94%,说明增加接种量有利于缩短菌群适应期并提高污染物去除效率。当接种量继续增加至9%时,苯酚降解率基本保持不变,为91.74%,而OD₆₀₀由0.256下降至0.214,表明进一步提高接种量并未明显改善降解效果。因此,从降解性能和经济性两方面考虑,选择7%作为较适宜的接种量。

由图5(b)可知,不同菌株接种比例对人工菌群降解性能影响明显。各比例条件下,吲哚降解率总体均维持在97.6%以上,变化幅度较小;相比之下,苯酚降解率差异较为明显。其中,Kl-TY2∶Kl-TY6∶Kl-TY8为1∶1∶1时苯酚降解率最高,达到91.59%,OD₆₀₀为0.275;1∶2∶1和1∶2∶2条件下苯酚降解率也分别达到91.41%和91.46%。而当比例为1∶1∶2和2∶1∶2时,苯酚降解率分别降至75.69%和70.38%,说明菌株Kl-TY8比例过高时不利于体系对苯酚的降解。综合比较各组结果,选择Kl-TY2∶Kl-TY6∶Kl-TY8=1∶1∶1作为后续优化实验的菌株配比。

综合各单因素实验结果可知,人工菌群Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8对吲哚的降解能力整体较强,而苯酚降解对环境条件和运行参数变化更为敏感,因此选择苯酚降解率为后续响应面优化的响应值。结合单因素实验结果,后续响应面优化选取温度、pH和苯酚初始浓度作为考察因素,并分别以30℃、pH 7和500 mg/L作为中心水平。

3.5 响应面优化实验

3.5.1 实验结果及方差分析

实验设计及结果见表3。

基于实验结果,采用Design-Expert 13软件对数据进行二次多项式回归分析,建立苯酚降解率与各因素之间的回归模型如式(2)所示。

(2)$\begin{array}{c} Y=90.66+7.7 X_{1}-0.205 X_{2}-2.83 X_{3}- \\ 4.11 X_{1} \cdot X_{2}+1.37 X_{1} \cdot X_{3}+2.02 X_{2} \cdot X_{3}- \\ 12.44 X_{1}^{2}-7.45 X_{2}^{2}-10.18 X_{3}^{2} \end{array}$

式中,Y为苯酚降解率,X₁、X₂和X₃分别为温度、pH和苯酚初始浓度。

方差分析结果见表4。

由表4可知,所建立的苯酚二次降解模型极显著,且失拟项不显著,说明模型拟合良好,可用于人工菌群Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8苯酚降解过程的分析与条件优化。同时,模型的相关系数R²为0.994 2,调整相关系数

${R}_{\mathrm{a}\mathrm{d}\mathrm{j}}^{2}$

为0.986 6,预测相关系数

${R}_{\mathrm{p}\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{d}}^{2}$

为0.923 7,表明该模型具有较高的拟合度和较好的预测能力^[21],能够较准确反映各因素与苯酚降解率之间的关系

从一次项分析结果来看,温度和苯酚初始浓度对苯酚降解率具有显著影响,其中温度影响最为显著,而pH的一次项影响不显著,说明在本实验范围内其线性作用较弱。结合F值可知,温度是影响人工菌群苯酚降解性能的主导因素。

从交互作用来看,温度与pH、pH与苯酚初始浓度之间均存在显著交互作用,而温度与苯酚初始浓度之间的交互作用不显著,表明二者之间的联合作用相对较弱。此外,A²、B²和C²均达到极显著水平,说明温度、pH和苯酚初始浓度与苯酚降解率之间均存在明显的非线性关系。

综合来看,温度、pH和苯酚初始浓度均会影响人工菌群对苯酚的降解效果,其中温度为最主要因素,苯酚初始浓度次之,该结果与单因素实验趋势基本一致。

3.5.2 交互作用分析及验证

进一步结合响应面等高线图和三维曲面图对各因素间的交互作用进行分析,结果见图6~图8。一般而言,响应面越陡峭,说明该因素对响应值的影响越显著;等高线越接近椭圆形,说明两因素之间的交互作用越明显,而接近圆形则表明交互作用较弱。

由图6可知,温度和pH对苯酚降解率存在较明显的交互影响。随着温度由低水平升高至中间水平,苯酚降解率明显提高,并在中性附近达到较高值;当温度或pH继续偏离适宜范围时,苯酚降解率均呈下降趋势。图中响应面变化较为明显,等高线呈椭圆趋势,说明温度与pH之间存在一定交互作用,该结果表明,适宜温度条件下,中性环境更有利于人工菌群维持较高的苯酚降解活性。

由图7可知,温度和苯酚初始浓度对苯酚降解率也具有共同影响。随着温度升高,苯酚降解率先升高后降低;随着苯酚初始浓度增加,响应值同样表现出先升高后下降的趋势。整体来看,响应面变化较明显,但等高线形状相对较圆,说明二者虽然共同影响苯酚降解率,但交互作用相对较弱。说明在本实验范围内,温度和苯酚初始浓度主要以各自独立作用影响人工菌群的降解性能。

由图8可知,pH和苯酚初始浓度之间同样存在一定交互作用。苯酚降解率在中性pH和中等苯酚浓度附近达到较高值,而在偏酸、偏碱或较高底物浓度条件下均出现下降。图中等高线呈一定椭圆趋势,响应面具有较明显的弯曲变化,说明pH与苯酚初始浓度之间存在显著交互影响。该结果表明,适宜的pH条件能够在一定程度上缓解较高苯酚浓度对菌群降解活性的抑制作用,但当两者同时偏离最适范围时,体系降解性能明显下降。

为验证响应面模型预测结果的可靠性,在上述最优条件下进行了3组平行验证实验。结果表明,苯酚实际降解率为91.78%,与模型预测值91.54%较为接近,误差为0.8%,说明模型预测值与实验实测值具有较好一致性,所建立的响应面模型能够较准确地预测人工菌群Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8的苯酚降解性能,具有较好的可靠性和实用性。

4 结论

(1)从焦化废水活性污泥中分离的菌株Kl-TY2、Kl-TY6和Kl-TY8经16S rDNA鉴定均为克雷伯氏菌属。结合近缘菌株信息及常见降解途径分析可推测,3株菌可能共享芳香族化合物降解主通路,并在苯酚和吲哚转化过程中形成一定代谢互补,说明该属菌在典型含氮芳香族污染物生物去除中具有较好应用潜力。

(2)2³全因子实验结果表明,在相同底物负荷下,三菌组合Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8在72 h内对苯酚和吲哚的去除率均超过90%,综合降解性能优于单菌及双菌体系,体现出复合菌群在实现苯酚-吲哚协同降解方面的优势。

(3)通过单因素和响应面法优化,确定最优条件为31.7℃、pH 7.03、苯酚初始浓度507.4 mg/L,在此条件下苯酚实际降解率为91.78%,与模型预测值高度一致,说明模型可靠。

(4)综合来看,人工菌群Kl-TY2+Kl-TY6+Kl-TY8在适宜工况下可实现高效苯酚-吲哚协同降解,为焦化废水等含苯酚-吲哚废水的生物处理工艺优化提供了一定参考,但仍需在真实废水和更复杂工况下进一步验证。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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