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一株贝氏不动杆菌的脱氮特性及废水处理研究

颜家静 ,  廖钰婷 ,  桂元 ,  刘根侨 ,  李仲玄 ,  王川

现代化工 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (S1) : 131 -138.

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现代化工 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (S1) : 131-138. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.S1.023
科研与开发

一株贝氏不动杆菌的脱氮特性及废水处理研究

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Study on denitrification characteristics and wastewater treatment of a strain of Acinetobacter baylyi

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摘要

从活性污泥中筛选出一株具备高效异养硝化-好氧反硝化能力的菌株,并深入研究其脱氮性能及实际应用潜力。最终筛选出一株高效异养硝化-好氧反硝化菌株NM3,鉴定为贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)。该菌株优先利用氨氮,降解过程无硝态氮累积。在丁二酸钠为碳源、C/N质量比=14、32℃、pH=7.82最优条件下,氨氮去除率达97.37%,对猪场、水产养殖废水氨氮去除率分别为77.14%、86.67%,具备良好废水处理应用潜力。

Abstract

A strain with high-efficiency heterotrophic nitrification-aerobic denitrification capacity was isolated from activated sludge,and its nitrogen removal performance and practical application potential were investigated in depth.Eventually,a high-efficiency heterotrophic nitrification-aerobic denitrification strain,designated as NM3,was screened out and identified as Acinetobacter baylyi.This strain preferentially utilizes ammonia nitrogen,with no accumulation of nitrate nitrogen during the degradation process.Under the optimal conditions of sodium succinate as the carbon source,C/N ratio of 14,temperature of 32℃ and pH of 7.82,the ammonia nitrogen removal rate reached 97.37%.Moreover,it achieved ammonia nitrogen removal rates of 77.14% and 86.67% for piggery wastewater and aquaculture wastewater respectively demonstrating favorable application potential in wastewater treatment.

Graphical abstract

关键词

贝氏不动杆菌 / 异养硝化 / 脱氮特性 / 氨氮去除 / 废水处理

Key words

Acinetobacter baylyi / heterotrophic nitrification / denitrification characteristics / ammonia nitrogen removal / wastewater treatment

引用本文

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颜家静,廖钰婷,桂元,刘根侨,李仲玄,王川. 一株贝氏不动杆菌的脱氮特性及废水处理研究[J]. 现代化工, 2026, 46(S1): 131-138 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.S1.023

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氮是导致水体富营养化的主要元素之一,过量氮引发的氮污染会破坏水体生态系统,如藻类大量繁殖、水体缺氧、鱼类死亡等,进而影响整个生态系统的平衡和人类的生存环境。因此,如何高效、经济地去除水体中的过量氮成为环境科学研究的热点和难点问题。
脱氮方法主要包括物理化学法和生物法。物理化学法虽然具有处理速度快、效果显著等优点,但往往伴随着高成本、易产生二次污染等问题。生物脱氮法因其成本低、环境友好、可持续性强等优势而备受关注。生物脱氮主要依赖于微生物的代谢作用,通过硝化和反硝化等过程将水体中的氨氮和硝态氮转化为氮气,从而实现氮的去除[1]。在众多参与脱氮过程的微生物中,异养硝化-好氧反硝化(Heterotrophic Nitrifying-Aerobic Denitrifying,HN-AD)菌株是一类能够在好氧条件下同时进行硝化和反硝化反应的微生物,HN-AD菌能同时完成硝化和反硝化过程,减少了工艺复杂性,降低了能耗和基建费用[2]。
常见的HN-AD菌有芽孢杆菌属、假单胞菌属、产碱杆菌属、副球菌属、不动杆菌属等。其中,不动杆菌具有较强的异养硝化和好氧反硝化能力,在处理含氮污染物时表现出高效的脱氮能力[3-4],不动杆菌对环境的耐受性强,能够在不同水质条件下发挥作用,包括贫营养水体。不动杆菌在脱氮过程中只产生氮气,不产生温室气体N2O,对环境友好,使用不动杆菌进行脱氮处理通常只需要一个好氧过程,操作和维护简便,因此不动杆菌被广泛应用于循环水养殖系统和养殖尾水的脱氮处理[5-6]。
不动杆菌稳定性和持续性可能受到环境因素的影响,因此寻找具有独特脱氮性能的不动杆菌仍是处理一些特殊废水的有效途径,不动杆菌在这些实际水体的复杂环境中的适应性和脱氮效率仍需进一步研究。
本研究从活性污泥中分离了一株具有较强异养硝化-好氧反硝化功能的贝氏不动杆菌,通过研究其脱氮能力和环境及营养因素对该不动杆菌生长及脱氮的影响,确定最适脱氮条件,为其应用于污水处理提供参考。

1 材料与试剂

1.1 样品来源

菌株分离样品采自内蒙古地区某酒厂废水处理的活性污泥。

1.2 培养基

(1)LB培养基(g/L):蛋白胨10 g,酵母浸粉 5 g,氯化钠10 g。
(2)BTB-反硝化培养基(g/L):硝酸钾1.0 g,丁二酸钠2.6 g,溴百里酚蓝(BTB,1%乙醇溶液) 1 mL,磷酸二氢钾1.2 g,硫酸镁1.2 g,硫酸亚铁 0.9 g,氯化钙0.1 g。
(3)氨氮硝化培养基(g/L):硫酸铵0.47 g,丁二酸钠3.36 g,维氏盐溶液100 mL。
(4)硝酸盐反硝化培养基(g/L):硝酸钠2 g,丁二酸钠3.36 g,维氏盐溶液100 mL。
(5)亚硝酸盐反硝化培养基:亚硝酸钠0.5 g,丁二酸钠3.36 g,维氏盐溶液100 mL。
(6)维氏盐溶液(g/L):磷酸氢二钾2.5 g,硫酸镁1.25 g,氯化钠1.25 g,硫酸锰0.03 g,硫酸铁0.03 g。
相应的固体培养基在液体培养基中加入质量分数3%的琼脂条即可。

2 实验方法

2.1 菌株的分离与纯化

取1 g活性污泥样品置于100 mL氨氮硝化培养基中,在30℃、150 r/min条件下培养48 h。取 5 mL培养液,接入新的氨氮硝化培养基中进行富集,然后取1 mL富集液梯度稀释(10-1~10-8倍),将其涂布于BTB-反硝化培养基平板,于30℃下培养48 h,挑取能使平板变蓝的单菌落进行划线分离纯化,筛选出脱氮能力较强的目的菌株。

2.2 菌株的筛选与鉴定

将筛选得到的目的菌株涂布于氨氮硝化的固体培养基中,观察平板中的菌落形态。提取目的菌株的DNA,以细菌16S rDNA通用引物27 F和1492 R,按以下条件进行聚合酶链式反应(PCR)反应:94℃预变性5 min、94℃变性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸2 min、变性到延伸共30个循环、72℃终延伸 10 min。将PCR产物送至上海生工生物工程公司进行测序,测序结果在美国国家生物技术信息中心(NCBI)中的基本局部比对搜索工具(Blast)进行序列比对分析,然后通过MEGA12软件用NJ法构建进化树。

2.3 菌株的生长曲线

将在氨氮硝化培养基中活化的菌液,接入分别以硝酸盐、亚硝酸盐和氨氮为唯一氮源的培养基,在30℃、120 r/min的条件下培养,每隔1 h测定一次菌液OD600值,以制作菌株生长曲线。

2.4 菌株对氮源的利用顺序

将1 mL活化后的菌液接种到混合氮源培养基中,培养基包含浓度均为100 mg/L的硝酸盐、亚硝酸盐和氨氮,于30℃、150 r/min的条件下培养,每隔3 h测定培养基中硝酸盐、亚硝酸盐和氨氮浓度,确定菌株的氮源利用顺序。再将菌株接种到以氨氮为唯一氮源的培养基中,于30℃、150 r/min的条件下培养,每隔3 h测定培养基中硝酸盐、亚硝酸盐和氨氮浓度。

2.5 菌株的脱氮条件优化

将菌株活化后接种于100 mL氨氮硝化培养基中,培养24 h。设置以下单因素实验:不同碳源(丁二酸钠、乙酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、乳糖、葡萄糖、琥珀酸钠)、不同碳氮质量比(C/N)(1、2、4、8、12、16)、不同初始pH(3、4、5、6、7、8、9、10)、不同温度(15、20、25、30、35、40℃)、不同转速(60、80、100、120、140 r/min)、不同接种量(2%、6%、10%、14%、18%)、不同装液量(8%、20%、40%、60%、80%)。测定培养液的氨氮含量以确定菌株脱氮的最佳条件。以上实验均设置3组平行。

2.6 响应面试验

以C/N(12)、pH(7)、温度(30℃)、装液量(40%)作为中心点,响应值(Y)值为氨氮去除率,设计响应面试验。具体试验设计方案如表1所示。

2.7 菌株对不同废水的处理效果

将菌株活化后按6%接种比例分别接种于装有 50 mL的含盐芽菜废水、水产养殖废水、猪场废水和造纸废水的250 mL三角瓶中,在30℃、120 r/min条件下处理48 h,检测废水的氨氮浓度。以不接种菌株的废水在同样条件进行培养作为对照。

2.8 分析方法

氨氮采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535—2009)、硝酸盐采用紫外分光光度法(HJ/T 346—2007)、亚硝酸盐采用分光光度法(GB 7493—1987)、OD600采用分光光度法、以上实验检测方法结果均使用微孔板光度计检测仪进行测定。使用Excel软件做数据统计、使用DPS数据处理系统对数据进行分析、使用OriginPro2024软件进行作图。

3 结果与分析

3.1 异养硝化-好氧反硝化菌的筛选及鉴定

通过富集培养和分离纯化,筛选出1株具有较强HN-AD特性的菌株并将其命名为NM3。NM3对硝酸盐、亚硝酸盐和氨氮的去除率分别为63.60%、67.31%和79.48%。NM3能使黄色的BTB-反硝化培养基变为深蓝色,显示出其反硝化能力。菌株呈淡黄色、非透明性状,表面隆起且光滑,边缘整齐,菌落粘稠[图1(a)]。基于菌株16S rDNA序列的比对和进化树结果显示[图1(b)],该菌株为贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)。

3.2 NM3的生长曲线

在氨氮培养基中,NM3在2 h后即进入对数生长期直到15 h,然后进入生长稳定期;在亚硝酸盐培养基中,NM3在5 h内处于生长迟缓期,然后进入生长对数期直到20 h,稳定期维持10 h后进入衰亡期;在硝酸盐培养基中,NM3在10 h内都处于生长迟缓期,10~20 h处于生长对数期,并在25 h后开始衰亡(图2)。
NM3在氨氮培养基中生长速度最快,能迅速进入对数期,表明该菌可能更偏好利用氨氮作为氮源。菌株在亚盐培养基中的生长速度适中,表明该菌种也能较好地利用亚硝酸氮作为氮源。菌株在硝酸盐培养基中的生长速度最慢,对数期最短,表明该菌种对硝酸盐的利用能力相对较弱。

3.3 NM3的脱氮能力

NM3在接种培养的3 h内,氨氮的去除率逐渐增加,在12 h时氨氮的去除率达到100%。NM3对亚硝酸盐的利用从第9 h开始,并随培养时间增加利用率逐渐增加,在第24 h时,NM3对亚硝酸盐的去除率达到49.33%,NM3未对硝酸盐进行利用,24 h内硝酸盐的含量一直未变化(图3)。进一步对NM3在以氨氮为单一氮源的培养基中培养时,NM3迅速利用氨氮,氨氮含量随培养时间逐渐减少,在 12 h时氨氮的含量降为0,并且在整个过程中,没有检测到亚硝酸盐和硝酸盐的存在(表2)。NM3在混合氮源中的培养表明该菌对氮源的利用顺序为氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐,这符合NM3在不同氮源中的生长曲线。
在以往文献中的不动杆菌也有类似的脱氮顺序,如A.junii NP1在同时存在氨氮和硝态氮时,会优先利用氨氮进行异养硝化[7];Acinetobacter sp.菌株先利用氨氮进行异养硝化,随后将生成的$N{\mathrm{O}}_{3}^{-}$/$N{\mathrm{O}}_{2}^{-}$反硝化为${{\mathrm{N}}_{2}}^{\left[8\right]}$。本研究是首次在贝氏不动杆菌中确认其脱氮顺序。部分不动杆菌在脱氮过程中会有硝酸盐及亚硝酸盐的累积[9],而NM3在利用氨氮时没有亚硝酸盐和硝酸盐中间产物产生,表明其脱氮时可能不经过反硝化过程,这种途径在Acinetobacter sp.C-13[10]和Acinetobacter sp.Y16[11]对氨氮的去除中也有发现。在这种脱氮过程中,氨氮一部分通过同化作用合成细胞物质,另一部分通过异养硝化-好氧反硝化途径直接转化为氮气,无中间产物累积。通过进一步的基因表达分析可以确定NM3的脱氮途径。

3.4 NM3的脱氮条件优化

3.4.1 碳源对NM3脱氮的影响

NM3对乙酸钠、乳糖、葡萄糖、丁二酸钠、柠檬酸钠、碳酸钙、琥珀酸钠等7种碳源均可利用,以葡萄糖和乳糖为唯一碳源时的氨氮的去除率较低,小于40%;以碳酸钙、柠檬酸钠和琥珀酸钠为唯一碳源时,菌株对氨氮的去除率有所增加,在55%~80%之间;以丁二酸钠和乙酸钠为唯一氮源的氨氮的去除率较高,均大于85%,其中丁二酸钠碳源下的氨氮的去除率最高达到了91.62%(图4)。不同的不动杆菌其最适的碳源种类不同,这些物质大都为三羧酸(TCA)循环的中间体,被菌体利用后可以直接参与TCA循环,从而促进菌株的生长。NM3的最适碳源为丁二酸钠,容易进入三羧酸循环,快速提供能量[12]。丁二酸钠也是其他HN-AD菌的碳源,如Thauera sp.SND5菌株[13]。

3.4.2 C/N对NM3脱氮的影响

NM3在C/N处于1~12区间时,氨氮的去除率随着C/N的增大而提升,并在C/N为12时氨氮去除率达到最大值95%;当C/N大于12之后,氨氮的去除率降低到81.30%[图5(a)]。较高的C/N表明其对碳源的利用的高效率,也使NM3有潜力应用于一些高碳含量的有机废水的处理。
C/N上升意味着碳源增加,可以满足菌株生长和代谢的需求,但碳源过量,会使培养基中的渗透压升高,进而抑制菌株的生长和代谢[14]。以往研究中的HN-AD菌的最适C/N通常为6~15[15],如A.junii 5-2的最佳的C/N是12[16]。

3.4.3 pH对NM3脱氮的影响

NM3对氨氮的去除率随pH的升高呈持续上升的状态,在pH为7时,菌株对氨氮的去除率达到了最大值94.26%;pH继续增大,氨氮的去除率开始有所下降;在pH为10时下降到81.44%,对比酸性环境,NM3在碱性环境中对氨氮的去除率更高,在pH范围在3~6时氨氮的去除效率在19%~72%,pH范围在7~10之间时氨氮的去除效率在80%~95%[图5(b)]。综上所述,NM3去除氨氮的最适pH为7,且更适应在中性和弱碱性环境生长和脱氮。
pH对脱氮过程的影响主要通过影响微生物的生长和酶活性,例如异养硝化过程中的关键酶羟胺氧化还原酶(HAO)。Acinetobacter sp.Y1的HAO在pH=3.0~10.0范围内均具有活性,但在pH=6.0~9.0时活性较强,且在pH=8.0时活性最强[17]。A.junii WZ17在pH为4~6时基本不生长,而当pH为7~8时,对氨氮的去除能力逐渐增强[18]。

3.4.4 温度对NM3脱氮的影响

当温度15℃时,NM3的氨氮去除率极低约为33%;当温度升高至20℃时,氨氮去除率显著上升至91%;随着温度升高,氨氮去除率持续升高,在30℃时达到了最高为95.10%;温度继续上升,氨氮的去除率有所下降,在20~35℃的温度范围内氨氮的去除率始终处于90%以上;温度上升至40℃时,氨氮的去除率才下降为76.3%[图5(c)]。温度通过影响酶活性对菌株生长及脱氮的能力有很大的影响。NM3在低温下的脱氮能力较差,其脱氮的最适温度为30℃,与Acinetobacter sp.ZH7[19]和A.junii YQ-1[20]类似,同时氨氮去除率高于这些菌株。NM3在20~35℃范围内的高氨氮去除率高于一些已报道的HN-AD菌,如Acinetobacter sp.L-1[21],Rhodococcus sp.LS-2[22],A.harbinensis HITLi7T[23]。NM3较宽的最适温度范围,表明其具有良好的环境适应性和应用潜力。

3.4.5 接种量对NM3脱氮的影响

NM3的氨氮去除率随接种量增加而增加,当接种量为6%时,其氨氮去除率达到最大为96.40%。随着接种量的继续增加,氨氮的去除率稍有下降,在18%接种量下的去除率为92.32%[图5(d)]。NM3在不同接种量条件下对氨氮的去除率的影响差异不明显,氨氮去除率均在92%以上,其生长和对氨氮利用的效率较高。接种量反映菌株的生长速度和脱氮效率,不同的菌株接种量有所不同,这与菌株特性有关,如A.junii YQ-1最佳接种量为2.0%,此时氨氮去除效率最高,达到82.64%[22]。A.johnsonii N26接种量为15%时,24 h后氨氮去除率可达98.9%[4]。

3.4.6 装液量对NM3脱氮的影响

NM3的氨氮去除率随装液量增加而增加,当装液量为20%时,NM3去除氨氮的能力最强,对氨氮的去除率达到97.05%,随着装液量的不断增加,NM3的氨氮去除率逐渐下降,装液量80%时氨氮去除率降到43.31%[图5(e)]。装液量对氨氮去除的影响主要体现在溶解氧浓度、传质效率以及代谢产物积累等方面。

3.4.7 转速对NM3脱氮的影响

转速从60 r/min开始增加,菌株对氨氮的去除率逐渐上升,当转速为120 r/min时,菌株对氨氮的去除率最高达到97.30%,当转速为140 r/min时,氨氮去除率下降至95.87%,在不同转速下氨氮去除效果均处于较高的水平,氨氮去除率均在90%以上[图5(f)]。转速主要通过影响溶解氧浓度从而影响菌株的生长以及脱氮效果。

3.5 响应面试验

以C/N(12)、pH(7)、温度(30℃)、装液量(20%)作为中心点,响应值(Y)值为氨氮去除率,对表3的试验数据进行多元回归拟合,得到回归方程如式(1)所示。
$\begin{array}{l}X=96.52+2.31A+2.55B+0.1733C-0.6892D+\\ 0.3875AB+0.5272AC-0.3775AD+1.49BC-\\ 0.9325BD+2.23CD-0.5145{A}^{2}-3.35{B}^{2}-\\ 4.82{C}^{2}-2.05{D}^{2}\end{array}$
由表4可知,该回归模型极显著(P<0.000 1),失拟项不显著(P>0.05),说明拟合程度良好。模型回归系数的决定系数R2=0.978 6,调整决定系数Radj=0.957 1,变异系数C.V.%=0.841 4,进一步验证了该方程的可靠性。通过比较各因素的主效应大小,得到主效应关系为B(pH)>A(C/N)>D(装液量)>C(温度)。基于构建的回归模型,通过响应面分析及其对应的曲面图(图6),探究了C/N、pH、温度、装液量这4个因素之间的交互作用如何共同影响氨氮去除率的动态变化过程。基于试验结果可知响应面实验最优条件为C/N=13.987、pH=7.818、温度32.118℃、装液量38.357%,在此条件下预测氨氮去除率为97.43%。为方便实际操作,将条件修正为C/N=14、pH=7.82、温度32℃、装液量38.36%,在此条件下实际测得氨氮去除率为97.37%。与装液量为20%时的氨氮去除率相比,响应面验证试验时38.36%的装液量时的氨氮去除率提高了0.32%,同一批能够处理的废水量提高了18.36%,所以最终选择的装液量为38.36%。

3.6 NM3对实际废水的应用

NM3对含盐芽菜废水和造纸废水处理效果较低,对猪场废水和水产养殖废水有良好的脱氮效果(表5),在48 h内NM3对猪场废水的去除率达到了70%以上,显示出对高氨氮的猪场废水的耐受和氨氮去除能力。NM3对水产养殖废水的氨氮去除率较为明显,48 h内可使废水中的氨氮降至1.6 mg/L,接近我国渔业水质标准,可实现对水产养殖废水的再利用。NM3对两种典型养殖废水的脱氮能力,相比一些不动杆菌处理废水的案例体现出了一定的优势,如对处理养猪废水的处理,NM3相比Acinetobacter sp.L-1[23]和Acinetobacter haemolyticus X-4[24],具有处理时间短和氨氮去除率高的特点。对于一些高氨氮的废水和垃圾渗滤液,NM3比Acinetobacter sp.TAC-1[25]和Acinetobacter sp.XJ-1[26]显著缩短了处理时间。NM3对水产养殖废水的高效脱氮,相比A.calcoaceticus A1[5],NM3处理的废水接近渔业水质标准。NM3能同时处理高氨氮的猪场废水和低氨氮的水产养殖废水,这在以往的不动杆菌中还鲜见报道,这表明其在处理养殖废水方面的潜力。

4 结论

(1)从活性污泥样品中筛选分离了一株高效异养硝化-好氧反硝化菌Acinetobacter baylyi NM3,NM3优先去除氨氮,其次是亚硝酸盐和硝酸盐,在去除氨氮过程中没有亚硝酸盐和硝酸盐累积。NM3脱氮的最优条件为碳源丁二酸钠,C/N=14、温度32℃、pH=7.82、转速120 r/min、接种量6%、装液量38.36%。NM3在20~35℃温度范围内具有较高的氨氮去除率,该温度区间涵盖了大多数城市污水和工业废水的实际运行温度,这有利于NM3在废水处理的应用。
(2)NM3对水产养殖废水中的氨氮去除效果较好,达到了86.67%。NM3对于高氨氮的猪场废水显示了一定的处理能力,氨氮去除率达到70%以上。研究结果表明NM3能处理高氨氮和低氨氮的养殖废水,将NM3与其他HN-AD菌或藻类联合使用,有望进一步降解废水中的氨氮。

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