现代化工

现代化工 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (3) : 242-247. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.03.039

分析测试

新型PPi的荧光探针制备及其在水样中的手机智能识别和生物成像应用

肖嘉扬 ¹ ,
朱砚山 ¹ ,
徐艺 ¹ ,
李杰 ² ,
吕琳 ² ,
高云 ¹^,^* ,
高妍 ¹

作者信息 +

Preparation of a novel fluorescent probe for PPi and its application in smartphone-based intelligent recognition in water samples and bioimaging

XIAO Jia-yang ¹ ,
ZHU Yan-shan ¹ ,
XU Yi ¹ ,
LI Jie ² ,
LV Lin ² ,
GAO Yun ¹^,^* ,
GAO Yan ¹

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Received		Published
2025-04-09		2026-03-20
Issue Date	Revised Date
2026-03-27	2025-04-09

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摘要

焦磷酸盐(PPi)是一种重要的阴离子,可参与生物体中新陈代谢和能量转换过程,PPi含量的监测对于疾病的早期预防和诊断有着重要作用。利用4-甲酰基-3-羟基-N-丁基-1,8-萘酰亚胺与5-胺基四氮唑为原料经缩合反应合成新型配体NRC,进一步与Fe³⁺配位原位制备可用于检测PPi的铁配合物NRC-Fe³⁺。利用HR-MS考察了探针NRC-Fe³⁺识别PPi的响应机制。探针NRC-Fe³⁺识别PPi的最低检测限为8.05 nmol/L。采用溶液比色法和探针试纸,实现了实际水样中PPi的定量评价,并采用基于NRC-Fe³⁺试纸的手机智能识别测定实际水样中PPi的含量,结果证明探针NRC-Fe³⁺可对实际水样中PPi进行快速实时检测。该探针对PPi的识别具有响应速度快(40 s)、抗干扰性强、毒性小等优点,已成功用于活鼠中对外源性PPi的生物成像研究。

Abstract

Pyrophosphate (PPi) is an important anion which can participate in the metabolism and energy conversion process in organisms,and the monitoring of PPi content is important for the early prevention and diagnosis of diseases.In this paper,a novel ligand NRC was synthesized by condensation reaction of 4-formyl-3-hydroxy-N-butyl-1,8-naphthalimide with 5-aminotetrazole,and then a fluorescence probe NRC-Fe³⁺ was prepared by the coordination of NRC with Fe³⁺.The response mechanism of NRC-Fe³⁺ for PPi was investigated by HR-MS.The detection limit of PPi recognition by the ligand NRC-Fe³⁺ was 8.05 nmol/L.The quantitative evaluation of PPi in buffer solution was realized by solution colorimetry and probe paper.Using smartphone-based intelligent recognition with NRC-Fe³⁺ test strips to determine the content of PPi in actual water sample,and the results demonstrated that the probe NRC-Fe³⁺ enables rapid quantitative detection of PPi in actual water sample.The probe NRC-Fe³⁺ has the advantages of rapid response (40 s),strong anti-interference and low toxicity,and has been successfully used in the bioimaging study of exogenous PPi in living mice.

Graphical abstract

关键词

萘酰亚胺 / 手机智能识别 / 生物成像 / 荧光探针 / 焦磷酸盐 / 铁配合物

Key words

naphthalimide / smart phone recognition / bioimaging / fluorescent probe / pyrophosphate / iron complex

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肖嘉扬,朱砚山,徐艺,李杰,吕琳,高云,高妍. 新型PPi的荧光探针制备及其在水样中的手机智能识别和生物成像应用[J]. 现代化工, 2026, 46(3): 242-247 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.03.039

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焦磷酸根离子(PPi)是三磷酸腺苷(ATP)水解的关键产物,在生物体内广泛参与能量代谢、糖的合成与分解、酶催化以及遗传物质的复制等重要的生理过程^[1-3]。通过检测尿液中的PPi水平,可以定量测定晶体焦磷酸钙脱水形成的钙,这种钙可导致多种骨关节疾病,包括人体内的软骨钙化症或假性骨质疏松症。此外,端粒酶活性也可以通过评估PPi的释放量来测定,这提供了包括DNA复制在内的细胞代谢过程的关键信息,对早期癌症的诊断非常重要^[4-5]。因此,研发合适的传感器检测和评估生物体系中的PPi水平已成为一个新兴的研究领域^[1,6-7]。

目前一些基于氢键或阴离子-π体系相互作用、金属-阴离子相互作用(螯合)、金属置换策略的PPi化学传感器已被研发出来^[8-13]。但是这类传感器还存在很多缺陷,如灵敏度差,对pH敏感,其他磷酸盐Pi、AMP、ADP和ATP的存在会对PPi的识别造成干扰^[14]。因此开发抗干扰性强、灵敏度高及生物活性好的PPi传感器具有非常重要的意义。

本研究以1,8-萘酰亚胺醛和取代胺基的四氮唑为原料,经由缩合反应成功制备新型配体NRC,配体NRC与Fe³⁺络合构建新型探针NRC-Fe³⁺,利用紫外和荧光光谱考查了探针NRC-Fe³⁺对PPi的识别性能。值得一提的是,采用基于NRC-Fe³⁺试纸的手机智能识别实现了对实际水样中PPi的半定量检测。由于NRC-Fe³⁺在识别PPi方面展现出显著优势,包括较高的灵敏度、迅速的响应以及较低的生物毒性,已被成功运用于小鼠中外源性PPi的荧光成像研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

4-甲酰基-3-羟基-N-丁基-1,8-萘酰亚胺、二甲基亚砜(DMSO)(AR,国药集团化学试剂有限公司)、三氟乙酸(AR,国药集团化学试剂有限公司)、5-氨基四氮唑、甲醇钠、正丁胺、冰醋酸、浓盐酸、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、乌洛托品、磷酸钠、过氧化氢、硝酸钠、浓硫酸、二十二碳六烯酸、半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化钾、九水硫化钠、亚硝酸钠、焦磷酸钠(PPi),以上试剂全部来自阿拉丁试剂公司,且纯度等级均达到了分析纯标准。

AniView100小动物活体成像系统(广州博鹭腾生物科技有限公司);AVANCE 400 MHz核磁共振波谱仪(Switzerland Bruker);CarlZeiss LSM900激光共聚焦显微镜(北京创诚致佳科技有限公司);6530Q-TOFLC/MC液相质谱联用仪(Agilent Technologies Inc);Lambda-900紫外分光光度计(PerkinElmer Inc.);LS55荧光分光光度计(PerkinElmer Instruments Company);ZF-7A手提式紫外分析仪[骥辉分析仪器(上海)有限公司];DAzo-6020真空干燥箱(精宏实验设备有限公司)。

1.2 实验方法

配体NRC的合成(图1):称量3-甲酰基-4-羟基-N-丁基-1,8-萘酰亚胺0.35 g(1.2 mmol),5-胺基四氮唑0.12 g(1.2 mmol),冰醋酸20 mL加至50 mL圆底烧瓶中。回流9 h,抽滤,柱分离得到目标产物。收率43.7%,HR-MS (positive mode m/z) for C₁₈H₁₆N₆O₃[NRC+H⁺]⁺:calcd:365.136 34,found:365.136 85。¹HNMR(DMSO-d₆,400 MHz),δ(ppm):10.37(s,1H),8.71(s,1H),8.69(d,J=4 Hz,1H),8.58(d,J=8 Hz,1H),7.89(m,2H),4.04(t,J=8 Hz,2H),1.64~1.57(m,2H),1.40~1.31(m,2H),0.95(t,J=8 Hz,3H)。¹³CNMR(DMSO-d₆,100 MHz),δ(ppm):194.55,164.85,163.62,162.94,133.99,133.13,131.59,130.42,127.43,123.84,122.71,1117.50,113.76,39.78,30.11,20.27,14.19。

1.3 荧光探针NRC-Fe³⁺识别性能的光谱分析

称取配体NRC 0.001 9 g于50 mL容量瓶中,以DMSO为溶剂定容,制备1×10^-4 mol/L的NRC浓溶液。避光保存。测试时用体积比为DMSO∶HEPES=2∶8的混合液稀释至1×10^-5 mol/L。取一定量的配体溶液加入等当量的Fe³⁺原位制备NRC-Fe³⁺探针。向NRC-Fe³⁺中加入分析物,采用紫外光谱和荧光光谱考察其对分析物的识别性能。荧光光谱测量时激发和发射狭缝分别为5、5 nm。

1.4 小鼠体内荧光成像

将一定浓度的配体NRC皮下注射至小鼠腿部,原位注射Fe³⁺,然后再注射一定浓度PPi,记录荧光随时间变化情况。

2 结果与讨论

2.1 探针NRC-Fe³⁺对PPi的紫外-可见吸收光谱响应

首先利用紫外光谱考察了探针NRC-Fe³⁺对阴离子和中性小分子的识别性能,结果如图2所示。

在DMSO/HEPES(2∶8,v/v,pH=7.2,20 mmol/L)条件下,将系列阴离子和中性小分子如Pi、PPi、H₂O₂、

$\mathrm{N}{O}_{2}^{-}$

、

$\mathrm{N}{O}_{3}^{-}$

、·OH、

${O}_{2}^{-}$

、NO、Hcy、GSH、Cys、DHA、S^2-(18 μmol/L)加入到探针NRC-Fe³⁺(10 μmol/L)溶液中,结果表明只有PPi可使探针NRC-Fe³⁺在425 nm处的吸光度增强,而加入其他分析物的探针溶液其紫外吸收并无明显改变。接下来考察了探针NRC-Fe³⁺对不同浓度PPi的紫外响应。如图3(a)所示,将PPi(0~18 μmol/L)加到探针NRC-Fe³⁺(10 μmol/L)溶液中,探针在425 nm的吸光度逐渐增强,达平衡时的紫外光谱与配体NRC的基本一致,如图3(b)所示。结果表明,探针NRC-Fe³⁺对PPi有良好的紫外响应能力。

2.2 探针NRC-Fe³⁺对PPi的荧光光谱响应

接下来考查了上述离子和分子对探针NRC-Fe³⁺荧光性能的影响。向探针溶液NRC-Fe³⁺中加入常见的阴离子和生物小分子如Pi、PPi、H₂O₂、N

${O}_{2}^{-}$

、S^2-、

${O}_{2}^{·-}$

、N

${O}_{3}^{-}$

、NO、Hcy、·OH、Cys、DHA、GSH(20 μmol/L),如图4(a)所示,当加入PPi后探针NRC-Fe³⁺的荧光大幅增强,而其他分析物Pi、H₂O₂、N

${O}_{2}^{-}$

、S^2-、

${O}_{2}^{·-}$

、N

${O}_{3}^{-}$

、NO、Hcy、·OH、Cys、DHA、GSH的加入则对探针NRC-Fe³⁺的荧光几乎没有影响。如图4(b)所示,只有加入PPi的探针NRC-Fe³⁺溶液的荧光由淬灭变为强绿光,且荧光与配体NRC的基本一致。而加入其他阴离子和中性小分子的探针NRC-Fe³⁺溶液的荧光则几乎没有改变。

在DMSO/HEPES(2∶8,v/v,pH=7.2,20 mmol/L)条件下,考查了不同浓度的PPi对探针NRC-Fe³⁺荧光光谱的影响。向探针NRC-Fe³⁺(10 μmol/L)溶液中加入PPi(0~18 μmol/L)后,探针NRC-Fe³⁺在540 nm处的荧光强度逐渐增强,当PPi浓度为 16 μmol/L时荧光最强且与配体NRC本身的荧光强度完全一致(图5),识别机制为PPi通过与Fe³⁺形成更为稳定的Fe³⁺-PPi复合物,使配体NRC从探针NRC-Fe³⁺中解离出来,从而使体系的荧光大幅增强。上述实验结果表明探针NRC-Fe³⁺能够高选择性识别PPi。

利用荧光滴定光谱考察了探针NRC-Fe³⁺识别PPi的检测限。如图6所示,在DMSO/HEPES(2∶8,v/v,pH=7.2,20 mmol/L)条件下,探针NRC-Fe³⁺的荧光强度与PPi浓度(0~9 μmol/L)呈良好的线性关系(R²=0.998 4),经拟合计算探针NRC-Fe³⁺识别PPi的检测限为8.05 nmol/L,能够满足对痕量级PPi的检测需要。

接下来考查了溶液pH对NRC-Fe³⁺接力识别PPi的影响,如图7所示,当溶液pH为3~9时,NRC-Fe³⁺的荧光为淬灭态。在pH为5~12范围时,NRC-Fe³⁺识别PPi后溶液荧光为最强。在考察的pH范围内NRC-Fe³⁺对PPi均展现出明显的荧光增强响应。

快速的荧光响应是性能优良的探针所具备的必要条件,如图8所示,向探针NRC-Fe³⁺(10 μmol/L)溶液中加入PPi(16 μmol/L),由图可知探针NRC-Fe³⁺的荧光强度在40 s时达到最大值。表明探针NRC-Fe³⁺可快速实现对PPi的识别。

2.3 探针NRC-Fe³⁺识别PPi的响应机制

结合上述紫外和荧光识别性能,提出了探针NRC-Fe³⁺识别PPi的响应机制,如图9所示。利用HR-MS考察了探针NRC-Fe³⁺识别PPi的响应机制。如图10所示,配体NRC加入Fe³⁺后在436.071 58处出现的离子峰可归为[NRC-2H⁺+Fe³⁺+H₂O]⁺,它可证明配体NRC和Fe³⁺为等量配位。如图11所示,进一步向NRC-Fe³⁺溶液中加入PPi后,质谱中436.071 58处的离子峰消失,在365.135 97处出现的离子峰[NRC+H⁺]⁺为配体NRC产生的。

2.4 探针NRC-Fe³⁺对实际水样中PPi的智能识别检测

向探针NRC-Fe³⁺溶液中加入用自来水配制的不同浓度的PPi,如图12所示,空白探针试样的荧光为黄绿色(a1),随着PPi浓度增加,探针溶液的荧光由绿色逐渐变为黑色(a2~a5)。它表明NRC-Fe³⁺可以在不借助大型仪器的情况下“裸眼”识别自来水中的PPi。

由于探针NRC-Fe³⁺无需借助仪器即可通过“裸眼”方式检测自来水中的PPi。为进一步提升实用价值,将探针NRC-Fe³⁺制成便于携带和保存的PPi测试条。如图13所示,随着PPi浓度的增加,测试条逐渐从黄绿色变为黑色。通过智能手机颜色识别系统对试纸条颜色进行数字化分析,发现试纸条的(R+G)/B值与PPi浓度之间存在良好的线性关系(图14)。结果表明,NRC-Fe³⁺试纸条可用于实际水样中PPi的快速实时检测。

2.5 活鼠体内PPi的荧光成像研究

接下来考察了小鼠体内NRC-Fe³⁺对PPi的生物成像性能,结果如图15(a),将10 μmol/L体积为100 μL的NRC皮下注射至小鼠右腿部位后产生了明显的荧光信号,随后将10 μmol/L体积为25 μL的Fe³⁺注射至同一部位后发现荧光呈逐渐减弱的趋势,于150 s后趋于稳定后原位继续注射20 μmol/L体积为25 μL的PPi。如图15(b)所示,小鼠腿部的荧光逐渐增强且于120 s时达到峰值。结果表明探针NRC-Fe³⁺可应用于小鼠体内对外源性PPi的荧光成像。

3 结论

以1,8-萘酰亚胺醛和取代胺基的四氮唑作为原料,通过缩合反应成功制备出新型配体NRC。随后,利用NRC与Fe³⁺之间的配位反应,原位制备出能够特异性识别PPi的荧光探针NRC-Fe³⁺。该荧光探针NRC-Fe³⁺可借助荧光“OFF-ON”模式,实现对PPi的高选择、高灵敏识别。识别的具体机制是由于当PPi与Fe³⁺结合后,会促使NRC从NRC-Fe³⁺中释放出来,进而使得体系的荧光大幅增强。探针NRC-Fe³⁺识别PPi的检测限可低至8.05 nmol/L。采用基于NRC-Fe³⁺试纸的手机智能识别对自来水中PPi进行半定量分析。值得一提的是该探针已成功实现了小鼠体内外源性PPi的荧光成像,凸显了其潜在的在环境检测和生物医学方面的应用价值。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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