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Si NPs-FITC比率荧光探针灵敏检测食品中环丙沙星的残留

贺莉 ,  马素黛 ,  年芳

现代化工 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (1) : 250 -255.

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现代化工 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (1) : 250-255. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.01.041
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Si NPs-FITC比率荧光探针灵敏检测食品中环丙沙星的残留

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Si NPs-FITC ratiometric fluorescent probe for sensitive detection of ciprofloxacin residues in food

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摘要

为解决牛奶和肉制品中环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)药物的残留问题,构建了一种新型探针,基于比率荧光传感技术实现CIP残留的检测。以3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)和单宁酸为原料,通过一步水热法快速制备了发射蓝色荧光的Si NPs,并与异硫氰酸荧光素(FITC)混合制备双信号发射的荧光探针Si NPs-FITC。通过TEM、XRD、FT-IR对Si NPs进行表征。基于CIP可以有效猝灭Si NPs-FITC探针荧光强度的现象,建立了快速、准确的检测环丙沙星的荧光新方法。在最优检测条件下,该方法的线性范围为8.54~400 μmol/L,检出限8.54 μmol/L。将该方法用于牛奶和肉制品中CIP的检测,表现出较高的稳定性和回收率,加标回收率为98.9%~106.6%。

Abstract

To solve the problem of ciprofloxacin (CIP) drug residues in milk and meat products,a novel probe was constructed in this study to realize the detection of CIP residues based on ratio fluorescence sensing technology.Blue-emitting Si NPs were rapidly prepared by a one-step hydrothermal method using 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) and tannic acid as raw materials,and then mixed with fluorescein isothiocyanate (FITC) to prepare a dual-signal-emitting fluorescent probe,Si NPs-FITC.Si NPs were characterized by TEM,XRD,and FT-IR.Based on the phenomenon that CIP can effectively quench the fluorescence intensity of the Si NPs-FITC probe,a rapid and accurate fluorescence method for the detection of ciprofloxacin was established.Under the optimal detection conditions,the linear range of this method was 8.54 to 400 μmol/L,and the detection limit was 8.54 μmol/L.When this method was applied to the detection of CIP in milk and meat products,it exhibited high stability and recovery rates,with the spiked recovery ranging from 98.9% to 106.6%.

Graphical abstract

关键词

荧光纳米材料 / 环丙沙星检测 / 比率荧光

Key words

fluorescent nanomaterials / ciprofloxacin detection / ratiometric fluorescence

Author summay

贺莉(1999-),女,硕士,助理工程师,研究方向为荧光纳米材料的制备及应用,。

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贺莉,马素黛,年芳. Si NPs-FITC比率荧光探针灵敏检测食品中环丙沙星的残留[J]. 现代化工, 2026, 46(1): 250-255 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.01.041

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食品安全问题深受国家和人民重点关注,且与每个公民的切身利益长期相关。在现代畜牧业和水产养殖业中,抗生素的普遍使用导致食品中抗生素残留问题日益严重。食品中抗生素残留会对人体健康构成多重威胁,如细菌耐药性、肠道菌群失衡、过敏反应、肝肾负担加重、儿童发育受阻以及潜在致癌风险。食品中抗生素检测作为食品安全监管的重要环节,对保障公众健康、维护食品贸易公平具有不可替代的作用。为了更好地监测动物性食品中抗生素的残留情况,建立高效便捷的检测方法十分必要。
环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)为合成的第三代喹诺酮类抗菌药物,用于治疗全身感染,包括尿路、呼吸道、胃肠道和皮肤感染,它是通过抑制细菌DNA螺旋酶的一个亚蛋白来影响细菌的生长和繁殖[1]。因其作用效果快,价格低廉而被广泛运用于家禽养殖业,CIP的滥用导致其极易残留在可食用动物体内并通过多种途径进入人体。人体中CIP过量会引发一系列的健康问题,如肌腱组织损伤、肝脏功能损害、神经系统异常反应以及耐药菌株的出现或可诱发癌症[2]。为保障食品质量安全,中国农业农村部制定了环丙沙星的残留限量标准并明确规定家禽产蛋期禁止使用[3]。目前我国对CIP的检测方法主要有表面增强拉曼光谱法[4]、毛细管电泳法[5]、酶联免疫分析法[6]、紫外分光光度法[7]等,这些方法能灵敏、准确检测CIP。但是存在样品前处理步骤繁琐、仪器昂贵,或者对抗体高度依赖、检测成本较高等问题。因此,建立灵敏、简单、成本低的检测方法至关重要。
荧光检测方法因检测速度快、灵敏度高、选择性好等优点被广泛用于食品安全检测。近年来,国内外在CIP荧光检测的领域取得可观的成果。然而,目前大多数荧光检测CIP的方法依赖于单一信号检测模式。这种检测方式容易受到探针浓度、激发波长以及环境因素等多重干扰,从而导致检测结果的准确性下降,影响对目标物质的定量分析。比率型荧光检测在提高方法准确性和稳定性方面具有显著优势,通过两个荧光信号的强度比值进行自校准[8],可以有效避免外界因素的干扰,从而提高检测的准确度和灵敏度。牛奶和肉制品的实际样品基质复杂,如牛奶中的蛋白质和脂肪,肉制品中的肌红蛋白和胶原蛋白等都会对CIP的检测造成显著干扰,使用比率型荧光检测能够提高准确度和选择性。
荧光硅纳米颗粒(Si NPs)是一种基于硅材料的纳米级荧光颗粒。Si NPs具有许多优异的性能,如出色的光学和电学性能,表面易于修饰,稳定性良好,且制备简单等。与传统荧光材料相比,Si NPs具有低毒性、优异的生物可降解性和生物相容性等优势。目前,Si NPs在化学和生物领域的研究中备受关注[9-13],被认为是一种有望替代有机染料和有毒重金属量子点的理想荧光探针[14-16]。例如,Zhang等[17]通过水热法制备了发射蓝色荧光的Si NPs,并应用于Hg2+的检测,该传感器具有较高的灵敏度和选择性;漆樟玉[18]则用一步合成法制备了荧光Si NPs,并将其用于细胞成像研究,该方法具有快速、灵敏、选择性好等优点。
本文中通过一步水热法高效制备了具有蓝色荧光特性的Si NPs,并将其与异硫氰酸荧光素(FITC)进行简易混合,成功构建了一种双发射荧光比率探针。对Si NPs的形貌和性质进行研究,Si NPs具有优异的稳定性。在最佳检测条件下,Si NPs-FITC比率探针实现了CIP的灵敏检测。该方法制备过程简单、检测范围宽、选择性好、抗干扰性强,并在实际样品中有较高的稳定性和回收率。Si NPs-FITC比率荧光探针为荧光检测CIP提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

真空冷冻干燥机(FD-1-50,北京博医康实);XD3 X射线多晶衍射仪(北京普析通用仪器有限责任公司);WQF-510A/520A傅里叶变换红外光谱仪(天恒科学仪器设备有限公司);荧光分光光度计(RF-5301PC,日本岛津公司);双光束紫外-可见分光光度计(TU-19,北京普析通用仪器有限责任公司)。
APTMS(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);异硫氰酸荧光素(FITC)、林可霉素(LIN)、链霉素(STR)、庆大霉素(GEN)、红霉素(EM)、甘氨酸(Gly)、卡那霉素(KANA)、葡萄糖(Glu)、单宁酸、盐酸环丙沙星(CIP)(上海源叶生物科技有限公司);其余试剂来源于天津市百世化工有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Si NPs的制备

向烧杯中依次加入2.2 mL超纯水、2 mL 0.2 g/L单宁酸溶液和0.8 mL APTMS,混合均匀后在常压条件下,于70℃水浴锅中静置30 min。将制备好的Si NPs冷却至室温后放入4℃的冰箱中备用。

1.2.2 CIP的检测

在磷酸盐缓冲溶液(PBS,10 mmol/L,pH 6.0)中,将200 μL的Si NPs溶液与80 μL 0.167 mmol/L的FITC溶液混合,并向其中加入不同浓度的CIP溶液,使其总体积为3 mL。室温反应7 min后,在315 nm的激发波长下,读取424、512 nm处的荧光强度。基于F424/F512值与CIP浓度之间的对应关系,绘制标准曲线。

1.2.3 实际样品的处理和CIP含量测定

首先量取5 mL牛奶,加入10 mL EDTA-Mcllvaine萃取剂,充分摇匀后超声处理20 min,随后以5 000 r/min离心15 min。取上清液并通过0.45 μm滤膜过滤,得到样品提取液。肉制品样品,称取5 g搅碎后的新鲜猪肉置于10 mL离心管中,加入EDTA-Mcllvaine萃取剂,以1 200 r/min漩涡振荡20 min以确保样品充分分散。随后超声处理20 min,以 5 000 r/min离心20 min,取上清液并通过0.45 μm滤膜过滤,得到样品提取液。将不同浓度的CIP标准溶液加入上述提取液中,按上述方法测定F424/F512值,并结合标准曲线计算样品中CIP的浓度。

2 结果与分析

2.1 Si NPs制备条件的优化

为了获得具有最强发射荧光的Si NPs,首先优化了Si NPs的合成条件。考察了反应时间、温度及还原剂单宁酸用量对Si NPs荧光强度的影响。如图1(a)所示,单宁酸(0.2 g/L)的体积在1.6~2.2 mL之间时,Si NPs的荧光强度先增大后减小,体积为 2 mL时Si NPs荧光强度最高;如图1(b)所示,反应时间在30 min时Si NPs的荧光值达到最强。图1(c)为不同温度下所制备的Si NPs的荧光强度,当温度达到70℃以上时荧光强度几乎不变,因此,选择单宁酸体积为2 mL、反应30 min、反应温度70℃为Si NPs的最佳制备条件。

2.2 Si NPs的表征

图2(a)是Si NPs的XRD图,表明Si NPs为非晶形相结构。如图2(b)所示,在3 358、3 139 cm-1处的吸收峰分别是O—H键的伸缩振动峰和N—H键的伸缩振动峰;2 919、1 475 cm-1处的吸收峰分别是C—H键的不饱和伸缩振动和C—H键的弯曲振动;1 592、1 398 cm-1处的峰为N—H键的弯曲振动和C—N键的伸缩振动;1 333、1 127~1 024 cm-1处的峰分别是Si—C键的不对称变形以及Si—O—Si的伸缩振动;921 cm-1处的峰是由Si—O键的伸缩振动产生,689 cm-1处的吸收峰是伯胺的伸缩振动。红外光谱分析结果表明,Si NPs表面富含羧基和氨基官能团,这些官能团的存在显著增强了其在水中的分散性能。从图2(c)中可以明显观察到所制备的Si NPs分散性好、尺寸均一。从中选择大约100个颗粒进行粒径统计,如图2(d)所示,Si NPs的平均粒径为3.25 nm,粒径范围在1.75 ~3.75 nm。

2.3 Si NPs的稳定性

为了在复杂的牛奶和肉制品的实际样品中灵敏检测CIP,考察了离子强度和光照时间对Si NPs荧光强度的影响。如图3(a)所示,在Si NPs溶液中加入 1~500 mmol/L NaCl溶液,随着溶液中盐浓度的增大,Si NPs的荧光强度基本保持稳定,表明Si NPs在高盐度环境中可以正常发光。图3(b)是Si NPs溶液在激发波长315 nm下连续照射60 min的荧光强度变化,可以看出Si NPs有较好的光稳定性和抗光漂白性。

2.4 Si NPs-FITC双发射荧光探针的构建

基于Si NPs良好的稳定性,向Si NPs溶液中加入80 μL 0.167 mmol/L的FITC溶液构建比率荧光探针。如图4(a)所示,当Si NPs单独存在时,荧光发射峰在490 nm,单独的FITC溶液的荧光发射峰在 512 nm。当FITC加入到Si NPs溶液后在315 nm激发下Si NPs-FITC混合溶液在490、512 nm处出现2个发射峰,成功构建了双发射荧光探针。如图4(b)可得,相较于Si NPs和FITC溶液的紫外-可见吸收光谱,当FITC加入后谱图中没有出现新峰,表明Si NPs和FITC混合后没有生成新物质。综上结果说明Si NPs和FITC是经过简单的混合得到了Si NPs-FITC比率荧光探针。

2.5 检测条件优化

如图5(a)所示,当PBS缓冲溶液处于酸性条件(pH<6.0)时,荧光强度F424/F512随pH的升高而逐渐增强,并在pH=6.0时达到最大值;然而,当pH>6.0时,其开始逐渐减弱。基于此,本研究选择pH=6.0作为最佳检测pH。此外,如图5(b)所示,在室温条件下向Si NPs-FITC溶液中加入CIP后,荧光强度在7 min后达到平衡并保持不变,表明反应在 7 min内完成。因此,实验确定7 min为最佳反应时间。

2.6 选择性和抗干扰性分析

实验考察了食品中常见的干扰物,如各种离子(Al3+、Ba2+、Ca2+、Fe2+、K+、Mg2+、)、LIN、STR、GEN、EM、KANA等对该方法的影响。在最佳检测条件下,向Si NPs-FICT中分别添加10 μL 10 mmol/L CIP溶液和20 μL 10 mmol/L上述干扰物质,测定溶液的荧光强度。如图6(a)所示,尽管干扰物质的浓度是CIP 2倍,但是只有CIP对Si NPs-FICT的荧光有显著的猝灭作用,其他上述干扰物质对其荧光没有明显变化,说明该方法具有较高的选择性。如图6(b)所示,当上述物质与CIP同时存在时,其对CIP的测定无明显影响,说明该方法具备较高的抗干扰能力。以上结果表明,该方法有望在复杂的牛奶和肉制品的实际样品中灵敏检测CIP。

2.7 Si NPs-FITC的检测原理

实验进一步探讨了Si NPs-FITC探针检测CIP的检测原理。由图7(a)可知,将Si NPs-FITC溶液和CIP混合后,未观察到新的UV吸收峰或UV曲线的偏移,表明在荧光探针和猝灭剂(CIP)猝灭过程中未形成新的化合物。由图7(b)所示,Si NPs-FITC的激发光谱与CIP的UV-Vis光谱面积大量重叠,Si NPs-FITC的发射光谱与CIP UV-Vis光谱面积几乎没有重叠。以上结果表明猝灭机理是内过滤效应(IFE)。

2.8 方法性能分析

在最优检测条件下,实验考察了不同浓度的CIP对Si NPs-FITC溶液荧光强度的影响(图8)。如图8(a)所示,在Si NPs-FITC溶液中加入2~100 μmol/L CIP溶液时,Si NPs-FITC的荧光强度在512、490 nm处发生了明显的猝灭,在490 nm处的荧光峰随着CIP浓度的增大不断蓝移,当到达424 nm处不再偏移,所以用F424/F512荧光值定量。F424/F512和CIP浓度之间存在较好的线性关系,线性拟合方程为F424/F512=0.295 1+0.009 3c(μmol/L),相关系数为R2=0.993 5,检出限是8.54 μmol/L。如图8(c)所示,当加入100~400 μmol/L CIP时,512、424 nm处的荧光强度均不断减小,线性拟合方程为F424/F512=0.890 3+0.003 6c(μmol/L),相关系数R2=0.996 2,检出限为22.47 μmol/L。与其他已经报道的方法相比,该检测方法有较宽的检测范围和较低的检测限。

2.9 实际样品中CIP的测定

为验证该方法在实际样品中的适用性,选取了日常生活中常见的牛奶和肉制品作为检测对象,具体实验结果如表1所示。为进一步评估该方法的准确性,对实际样品进行了加标回收率实验,结果显示回收率范围为98.9%~106.6%,相对标准偏差(RSD)低于3%。结果表明该方法在实际样品检测中表现出较高的准确性和可靠性,具备良好的实际应用潜力。

3 结论

以APTMS和单宁酸为原料,在常压下静置30 min制备Si NPs,并加入FITC溶液成功制备发射双信号的荧光探针Si NPs-FITC。基于IFE效应,CIP能够有效猝灭Si NPs-FITC的荧光信号,从而构建了一种新型的CIP比率荧光检测方法。该方法具有操作简便、成本低等特点,同时避免了传统合成过程中烦琐的多步操作以及对复杂仪器的依赖。实验结果表明,所制备的Si NPs具有优异的盐稳定性和光稳定性。与FITC混合后形成了灵敏度高、选择性好的比率荧光探针,实现了CIP的灵敏检测。该方法不仅有较低的检出限和较宽的线性范围,还表现出优异的选择性。此外,实际样品分析结果进一步验证了该方法在实际应用中的可行性和可靠性。

参考文献

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基金资助

甘肃农业大学公招博士科研启动基金项目(GAU-KYQD-2018-13)

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