现代化工

现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (S2) : 285-290. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.S2.050

科研与开发

高效苊降解菌的分离、鉴定及降解特性研究

康菱珂 ¹ ,
刘晓娜 ¹^,² ,
钱天伟 ¹^,²^,^* ,
李博 ²

作者信息 +

Isolation,characterization and degradation properties study of highly efficient acenaphthene-degrading bacteria

KANG Ling-ke ¹ ,
LIU Xiao-na ¹^,² ,
QIAN Tian-wei ¹^,²^,^* ,
LI Bo ²

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文章历史 +

Received		Published
2025-03-13		2025-09-30
Issue Date	Revised Date
2025-10-29	2025-03-13

PDF (3382K)

摘要

从焦化污染的土壤中成功分离出一株具有高效苊(Acenaphthene,ACE)降解能力的菌株AC-1,经鉴定该菌株属于不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。在pH 6.0~8.0、30℃的条件下,菌株AC-1对50 mg/L苊的降解率达65.96%。进一步的广谱性测试发现,该菌不仅能降解苊,还可有效降解萘、芴及菲。此外,通过与萘的共代谢,菌株AC-1对苊降解率提升至82.61%。中间产物分析检测到水杨酸正己酯等,表明菌株AC-1可能通过水杨酸途径实现苊的降解。研究结果为PAHs污染场地的生物修复提供了有效菌种资源及理论依据。

Abstract

A strain AC-1 with efficient acenaphthene degrading ability is successfully isolated from coke-contaminated soil,and identified as belonging to the genus Acinetobacter sp.The results show that the degradation rate of 50 mg/L acenaphthene by strain AC-1 at pH 6.0-8.0 and 30℃ reaches 65.96%.It is found by further broad-spectrum tests that this bacterium can not only degrade acenaphthene,but also degrade naphthalene,fluorene,and phenanthrene effectively.In addition,by co-metabolizing with naphthalene,the degradation rate of acenaphthene by strain AC-1 increases to 82.61%.Salicylic acid and others are determined through detecting intermediate products,suggesting that strain AC-1 can achieve degrading acenaphthene via the salicylic acid pathway.Study results provide effective strain resources and a theoretical basis for bioremediation of PAHs-contaminated sites.

Graphical abstract

关键词

多环芳烃 / 共代谢 / 广谱降解 / 苊降解 / 不动杆菌

Key words

PAHs / co-metabolism / broad-spectrum degradation / acenaphthene degradation / Acinetobacter sp.

Author summay

康菱珂(2000-),女,硕士生,研究方向为微生物修复技术,13935006192@163.com

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康菱珂,刘晓娜,钱天伟,李博. 高效苊降解菌的分离、鉴定及降解特性研究[J]. 现代化工, 2025, 45(S2): 285-290 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.S2.050

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多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbon,PAHs)是全球性环境问题之一^[1]。它具有遗传毒性、诱变性和致癌性,对生态环境和人类健康构成了极为严重的威胁。由于多环芳烃同时具有高疏水性和低生物可利用性,它们在自然环境中难以被降解,从而在环境中不断累积,形成了持久性的污染^[2]。焦化行业作为PAHs的主要人为排放源之一,其排放量占全球人为排放总量的13%~16%^[3],已成为环境管控的重点领域。因此,焦化行业在PAHs排放方面的影响不容忽视,必须采取有效措施。

近年来,PAHs污染的治理技术取得了进展,主要包括物理修复、化学修复和生物修复^[4]。然而,传统的物理和化学修复方法存在诸多弊端,如成本高昂、能耗巨大且可能引发二次污染。相比之下,生物修复因其成本低、环境友好且无二次污染等优点,被认为是最具潜力的策略^[5]。微生物降解是生物修复的核心手段之一,但现有研究多集中于低环多环芳烃(如萘和菲等)的降解^[6],对于三环多环芳烃苊(Acenaphthene,ACE)的微生物降解研究较少,且环境因素对微生物降解能力的影响尚未得到充分探讨。

本研究从焦化场地中分离出一株高效苊降解菌菌株AC-1,系统研究了环境条件对其降解能力的影响,并探讨了菌株AC-1对其他PAHs的广谱降解作用。此外,通过外源添加不同碳源进行共代谢实验,提升了菌株AC-1对苊的降解率,并通过中间产物检测推断出苊的微生物降解途径。本研究旨在为PAHs的生物修复提供理论参考,为环境污染治理提供新的思路和解决方案。

1 材料和方法

1.1 菌株AC-1的分离和筛选

1.1.1 培养基制备

实验中使用的培养基是Luria-Bertani(LB)培养基和矿物盐培养基(MSM)。LB培养基含10.0 g/L蛋白胨、5.0 g酵母提取物和10.0 g氯化钠,使用前将pH调至7.0。MSM培养基为3.24 g/L K₂HPO₄、0.87 g Na₂HPO₄、2.0 g NH₄Cl、0.2 g MgSO₄·7H₂O和1 mL微量元素溶液,pH为7.0。固体培养基是在液体培养基中加入15 g/L的琼脂。在细菌接种前,培养基在121℃和100 kPa下高压灭菌20 min。

1.1.2 土壤样品采集

土壤样品采集于中国山西省某焦化厂。按照Yang等^[7]的方法,首先进行土壤预处理,取10 g PAHs污染土壤,加入90 mL无菌生理盐水,于30℃、150 r/min转速下振荡5 h,静置30 min后取 5 mL上清液作为初始菌源。然后将菌源接种至含50 mg/L苊(唯一碳源)的MSM培养基中,于30℃、150 r/min的条件下振荡培养7 d,连续转接7代。最后将富集液梯度稀释(10^-1~10^-6),涂布于苊-MSM固体平板,30℃避光培养5 d,挑取单菌落经3次平板划线纯化,获得纯菌株AC-1。

1.2 菌株鉴定

1.2.1 形态学观察

将菌株培养液稀释、经革兰氏染色后,在显微镜下对细菌进行观察。使用扫描电子显微镜(SEM)表征菌株的表面形态。

1.2.2 分子生物学鉴定

将筛选出的苊优势降解菌株以2%的接种量接种至培养基中,培养7 d,然后取出2 mL培养液于离心管中贮藏,送至北京六合华大基因科技有限公司测序。将测序结果输入到NCBI网站进行Blast比对,运用MEGA7.0软件构建系统发育树。

1.3 菌株AC-1的降解特性研究

为了系统评估菌株在不同环境条件下对苊的降解效率,本研究设计了一系列单因素实验。考察不同pH(5、6、7、8、9)、不同温度(15、25、30℃和35℃)和不同的苊初始浓度(0、25、50、75 mg/L和100 mg/L)对降解效率的影响。还探讨了不同碳源对菌株 AC-1降解苊能力的影响。实验设置了4组条件:第1组添加50 mg/L的萘作为碳源;第2组和第3组分别添加碳当量的醋酸钠和葡萄糖作为碳源;第4组为对照组,不添加额外碳源。所有实验组菌株均以2%的接种量接种,并定期取样。所有实验均有3组平行样本,以确保结果的准确性和可重复性。

1.4 苊的中间产物分析

培养基接种50 mg/L苊,在30℃和pH为8的条件下培养13 d。每隔48 h,取等体积的培养液并用10 mL乙酸乙酯进行第1次萃取。随后,用盐酸将萃取液酸化至pH为2.3,再用乙酸乙酯进行第2次萃取。合并所有萃取液后,用旋转蒸发仪浓缩。将浓缩后的溶液溶解在200 μL的甲醇中,使用气相色谱质谱法(GC-MS)分析苊的中间代谢物。

2 结果与讨论

2.1 苊降解菌的分离和特征描述

如图1(a)所示,固体培养基上的菌落呈圆形,直径约2~3 mm,外表光滑,呈白色,边缘模糊。它们能在以苊为唯一碳源的培养基中生长,说明菌株具有降解苊的能力。图1(b)所示的革兰氏染色结果显示,染色后呈红色,说明该菌株为革兰氏阴性。图1(c)为菌株在扫描电镜下的图像,可见菌体为杆菌,长约0.6~0.9 μm,宽约0.5~0.7 μm。

通过16S rDNA测序及Genbank数据库序列比对,发现菌株AC-1与不动杆菌(Acinetobacter sp.)的同源性最高,序列相似度达到99.9%。采用邻域连接法构建了系统发育树(图2),显示菌株AC-1与多株不动杆菌具有高度同源性。综上,依据菌株AC-1的形态特征以及分子生物学鉴定结果,将菌株AC-1鉴定为不动杆菌。

2.2 环境条件对菌株AC-1降解苊的影响

2.2.1 pH

图3显示了菌株AC-1在不同pH(5、6、7、8、9)条件下的降解能力。11 d后,降解率较高的为pH=6~8,降解率在60%以上;其次为 pH=5和9,降解率分别为54.26%和51.77%。结果表明,菌株AC-1在pH为5~9的范围内均能有效降解苊,且在pH为6~8的中性条件下效果最佳。由于苯环是PAHs的基本骨架,其电离状态受pH影响较大,因此环境pH对微生物降解苊具有显著影响。同时,极酸和极碱条件也会破坏酶蛋白结构中的氢键,影响生物降解过程^[8]。此外,pH对细菌的生长也有直接影响。Rousk等^[9]发现,微生物在中性或接近中性的pH水平下生长更为旺盛。因此,菌株AC-1在pH为5和9时降解效率相对较低,而在中性pH=6~8范围内降解效率最高。

2.2.2 温度

本研究评估了不同温度条件下,菌株AC-1对初始浓度为50 mg/L的苊的降解能力。图4显示了菌株AC-1在不同温度(15、25、30、35℃)下的降解效率。经过11 d的培养,结果显示在30℃和35℃时,苊的降解率超过了60%;而在15℃和25℃时,降解率仅为15%~25%。这些结果表明,在一定范围内,菌株AC-1对苊的降解率随着温度升高而增加。这一发现与Moayed等^[10]的研究结果一致,微生物在不同温度(25、40、60℃和70℃)下降解PAHs的降解率各不相同。较高的温度会促进微生物的生长和新陈代谢,从而提高其降解效率,而较低的温度会严重限制PAHs的生物降解^[11],这主要是由于低温抑制了微生物的生物活性,并降低了PAHs的溶解度^[12]。温度对微生物降解效率的影响机制主要体现在2个方面:一是温度影响微生物细胞内降解酶的活性,从而影响PAHs的降解;二是温度能够改变PAHs在土壤中的溶解度,进而改变其生物利用性^[13]。

2.2.3 苊初始浓度

图5显示菌株AC-1在不同初始浓度下对苊的降解效率。当苊的初始浓度为25 mg/L时,降解率最高,11 d后达到95.03%。当初始浓度为50、75 mg/L和100 mg/L时,降解率依次降低,分别为65.96%、51.57%和35.83%。这些结果表明,污染物的初始浓度与PAHs的生物降解效率呈负相关。高浓度的污染物会对多环芳烃的降解过程产生显著的抑制作用,而低浓度的污染物则更有利于PAHs的降解,通常会导致更高的降解效率^[14]。在本研究中,菌株AC-1的降解效率随着苊的初始浓度的增加而降低,这可能是由于高浓度苊可直接与微生物DNA结合,造成其断裂或突变;或者改变细胞膜通透性,造成组织液渗漏;同时还可能导致细胞内产生过量活性氧,攻击细胞内蛋白质和脂质,从而抑制微生物代谢,降低降解效率^[15]。此外,高浓度的PAHs及其代谢中间产物的累积也可能对降解菌产生毒害作用,抑制微生物的生长和降解能力^[16]。

2.3 菌株AC-1对PAHs的广谱降解作用

图6显示了菌株AC-1对4种混合PAHs(萘、苊、芴和菲)的降解情况。结果显示,菌株AC-1对这4种污染物的降解程度存在显著差异。值得注意的是,在混合PAHs中,萘的降解速度最快,在24 h内开始降解,并在7 d后完全降解。这表明菌株 AC-1优先利用萘作为碳源,这与Zhang等^[17]在研究菌株SHPJ-2降解混合PAHs时的观察结果一致。随后,苊在1 d后开始降解,7 d后降解率达到48.86%。与单独降解苊时相比,混合降解7 d的降解率要低约4%,这一结果表明,其他PAHs的存在可能会抑制苊的降解,这与Hennessee等^[18]的研究结果一致,该研究发现单一PAH降解与混合PAH降解之间的代谢差异,以及混合降解中的拮抗作用。

芴降解从1 d后开始,2 d后稳定在13.65%,而菲降解最慢,7 d后降解率为11.73%。这些结果证实了菌株AC-1对萘、苊、芴和菲的降解能力。这种差异可能是由于PAHs的种类和浓度增加,对降解细菌的活性产生了明显的抑制作用。Song等^[19]也有类似的发现,他们观察到菌株S01对单一底物萘、菲和芘的降解率分别为95.34%、87.59%和55.11%。然而,当这些PAHs存在于混合物中时,降解率分别降至75.22%、66.03%和46.54%。

Ansari等^[20]研究了在土壤生物修复中能够降解PAHs的各种微生物的生长情况,发现PAHs的生物降解性因其化学结构而异,较小、较简单的化合物通常能更快地被微生物分解。经过5 d的降解,混合系统菌株AC-1对4种PAHs的降解能力依次为萘>苊>芴>菲。当多种PAHs共存时,细菌可能会根据底物偏好选择性降解一种或多种化合物^[21]。

不同的降解率可能是由于分子结构和苯环数量的不同造成的:萘是水溶性最高的双环多环芳烃,而苊、芴和菲是三环化合物,其中苊的水溶性最高。Sharma等^[22]还发现,7 d后,混合菌株对芴、菲和芘的降解率分别为75%、67.8%和39.2%,降解率随着环数的增加而降低。此外,PAHs分子大小会影响疏水性和电化学稳定性,这也会影响降解的难易程度^[23]。

2.4 共代谢对菌株AC-1降解苊的影响

图7展示了苊在不同碳源(葡萄糖、醋酸钠和萘)条件下的降解情况。经过12 d的培养,以萘作为额外碳源的降解率达到82.61%,而以醋酸钠和葡萄糖作为额外碳源的降解率分别为78.30%和73.10%。与不添加碳源的降解相比,降解率分别提高了16.86%、12.55%和7.35%。这表明,添加额外碳源能够显著提升苊的降解效率。

添加萘作为额外碳源时,对AC-1菌株降解苊的促进作用最为明显。这可能是由于一些低环(LMW)PAHs加入共代谢,很容易促进原PAHs的降解^[24]。这种促进作用可能与水相中溶解的萘穿过细菌的细胞膜到达并分散在细胞质中有关。这一过程诱导了相关降解酶的有效表达,从而促进了系统中其他PAH底物的降解^[25]。

2.5 菌株AC-1对苊的降解机制

在微生物降解过程中,分析中间代谢物对于揭示多环芳烃(PAHs)降解机制具有重要意义。本研究以不动杆菌菌株AC-1为研究对象,通过GC-MS分析其对苊降解过程中的中间产物,以阐明其生物降解途径。结果表明,菌株AC-1在降解苊的过程中,主要检测到的中间产物包括苊、1-苊醇、1,2-二羟基苊和水杨酸正己酯。这表明不动杆菌菌株 AC-1可能通过水杨酸代谢途径实现对苊的降解,其降解途径如图8所示。

苊首先通过初级氧化反应生成1-苊醇,然后在脱氢酶的作用下转化为1-苊酮,这与Ghosal等^[26]研究不动杆菌AGAT-W降解苊的结果一致。1-苊酮进一步发生羟基化反应,生成1-羟基-2-酮基苊,随后通过可逆的互变异构化反应生成1,2-二羟基苊。Mallick等^[27]在鞘氨醇单胞菌降解苊的研究中提出了相似的降解途径。1-苊酮经过羟基化反应生成1-羟基-2-酮基苊,再经过可逆异构化反应生成1,2-二羟基苊。在Wang等^[28]发现的希拉菌(Shinella sp.)降解苊的中间产物中也检测到了1-苊醇和1,2-二羟基苊的存在。这表明上述降解途径在不同菌株中具有一定的普适性。1,2-二羟基苊在脱氢酶的作用下进一步生成苊醌,最终转化为水杨酸。水杨酸作为关键中间产物,可进一步代谢并进入三羧酸循环(TCA循环),从而完成苊的完全矿化^[28]。

3 结论

(1)从焦化厂污染土壤中分离出一株高效降解苊的菌株AC-1,通过形态分析、革兰氏染色和16S rDNA测序,鉴定其为不动杆菌(Acinetobacter sp.)。

(2)菌株AC-1降解的适宜条件为pH=6.0~8.0和温度30℃,在此条件下对50 mg/L苊的降解率可达65.96%。

(3)菌株AC-1不仅对苊具有高效的降解能力,还对多种多环芳烃(包括萘、芴和菲)表现出广谱降解能力,这进一步证实了其在生物修复中的应用潜力。

(4)共代谢实验发现,添加萘作为外加碳源共代谢可进一步增强菌株AC-1对苊的降解效果。

(5)通过对降解过程中间代谢物的分析发现菌株AC-1通过水杨酸途径降解苊,这一代谢途径的明确为优化降解过程提供了理论基础。

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原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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