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胶质类芽孢杆菌衍生氮掺杂碳量子点及其缓解烟草盐胁迫的研究

牛旭朝 ,  田保华 ,  张国艳 ,  冯军鹏 ,  曹青 ,  梁海霞

现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (S2) : 219 -225.

PDF (5303KB)
现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (S2) : 219-225. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.S2.039
科研与开发

胶质类芽孢杆菌衍生氮掺杂碳量子点及其缓解烟草盐胁迫的研究

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Study on nitrogen-doped carbon quantum dots derived from Paenibacillus mucilaginosus for alleviating salt stress in tobacco

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摘要

采用一步水热法以不同碳氮比下的P.m.菌体为前体合成氮掺杂碳量子点(N-CQDs),对其进行结构表征,评估其自由基清除能力及对烟草盐胁迫(NaCl)氧化损伤的影响。结果表明,N0.5-CQDs比N0-CQDs和N5-CQDs具有更多的—OH、—COOH和—NH2官能团,显示最强自由基清除能力;N0.5-CQDs对$\cdot \mathrm{O}_{2}^{-}$、·OH和DPPH·清除率分别为76.3%、60.9%和79.3%,半抑制浓度IC50为0.86、1.72 mg/mL和0.71 mg/mL。NaCl处理使烟草叶片过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量升高,棕色沉淀增多;而N0.5-CQDs+NaCl显著缓解NaCl诱导的H2O2和MDA含量升高,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性分别提升27.73%和22.25%,抗坏血酸(ASA)和谷胱甘肽(GSH)含量增加31.91%和30.49%。研究表明,N0.5-CQDs协同增强烟草抗氧化酶活性与抗氧化物含量,缓解盐胁迫的氧化损伤。

Abstract

To examine the regulation of antioxidant capability of Paenibacillus mucilaginosus(P.m.)-derived Carbon Quantum Dots (CQDs) by carbon to nitrogen ratio.Nitrogen-doped carbon quantum dots (N-CQDs) were synthesized through a one-step hydrothermal method using P.m.cultured under varying carbon-to-nitrogen (C∶N) ratios.The synthesized N-CQDs were analyzed by TEM,XPS,FT-IR and XRD characterization methods,their free radical scavenging capacity and their protective effects against NaCl stress-induced oxidative in tobacco were systematically investigated.The results showed that N0.5-CQDs exhibited superior free radical scavenging capacity compared to N0-CQDs and N5-CQDs,attributed to their higher content of hydroxyl (—OH),carboxyl (—COOH),and amino (—NH2) functional groups;N0.5-CQDs exhibited optimal radical scavenging activity,demonstrating removal rates of 76.3% for superoxide radicals ($\cdot \mathrm{O}_{2}^{-}$),60.9% for hydroxyl radicals (·OH),and 79.3% for DPPH radicals,with corresponding IC50 values of 0.86,1.72,and 0.71 mg/mL,respectively.Under NaCl stress,the H2O2 and MDA contents of tobacco leaves were significantly increased,accompanied by visible brown precipitation;Furthermore,the N0.5-CQDs+NaCl treatment reduced H2O2 and MDA accumulation and enhanced the activity of key antioxidant enzymes,increasing superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities by 27.73% and 22.25%.Concurrently,it elevated non-enzymatic antioxidant levels,with ascorbic acid (ASA) and glutathione (GSH) contents rising by 31.91% and 30.49%,respectively.These results demonstrate that N0.5-CQDs exhibit dual antioxidant functionality:synergistic upregulation of both enzymatic (SOD,CAT) and non-enzymatic (ASA,GSH) antioxidant systems,collectively attenuating NaCl-induced oxidative damage in tobacco.

Graphical abstract

关键词

C∶N比 / 盐胁迫 / 活性氧 / 碳量子点 / 胶质类芽孢杆菌

Key words

C∶N / salt stress / reactive oxygen species / carbon quantum dots / Paenibacillus mucilaginosus

Author summay

牛旭朝(2000-),男,硕士生,研究方向为纳米材料,

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牛旭朝,田保华,张国艳,冯军鹏,曹青,梁海霞. 胶质类芽孢杆菌衍生氮掺杂碳量子点及其缓解烟草盐胁迫的研究[J]. 现代化工, 2025, 45(S2): 219-225 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.S2.039

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受全球气候变暖、降雨模式改变和灌溉不足等因素影响,土壤盐分持续累积,导致植物生长抑制,土壤盐渍化是制约全球农业生产的重要环境胁迫因素。盐胁迫(Salt stress,如NaCl)可诱导植物体内活性氧(ROS)的积累,包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子($\cdot \mathrm{O}_{2}^{-}$)和羟基自由基(·OH)等,进而引发氧化损伤并破坏细胞稳态[1]。植物可通过抗氧化系统清除过量ROS,但长时间胁迫导致植物体抗氧化系统失衡[2]。因此,迫切需要通过外源干预策略增强植物耐盐性,这已成为农业可持续发展的重要研究方向。
碳量子点(Carbon quantum dots,CQDs)是由sp2/sp3杂化碳核构成的新型纳米材料,富含羟基(—OH)和羧基(—COOH)等官能团,赋予其优异的水溶性和可修饰性[3]。通过异质元素掺杂(如氮、硫等)或表面功能化,可进一步调控CQDs的光学特性、电子结构及表面化学活性,从而扩展应用范围[4]。近年来,基于生物质绿色合成的CQDs因其环境友好、成本低廉等优势受到广泛关注,其表现出超小尺寸(<10 nm)、高荧光量子产率、生物相容性和低毒性等特征[5]。其中,植物源生物质(如甘蔗渣、绿茶叶渣、百香果壳)已被成功合成高性能CQDs[6]。微生物源如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌或酵母菌等真菌可制备多功能CQDs[7]。目前,基于生物质的CQDs已在生物成像、化学传感及植物抗逆等领域展现出应用潜力。例如丹参水热法合成的CQDs可显著提升意大利生菜的耐盐性,证实在植物胁迫调控中的价值[8]。
氮掺杂可引入氨基(—NH2)、吡咯氮等活性基团,通过调节CQDs的能带结构和表面电子密度,显著增强其自由基清除能力(如·OH、$\cdot \mathrm{O}_{2}^{-}$)及电子传递效率[9]。如Jing等[10]开发的氮掺杂CQDs可有效缓解拟南芥在盐胁迫下的氧化损伤,表明开发功能化CQDs在农业中具有广阔的应用前景。以调节培养基碳氮比(C∶N)获得的胶质类芽孢杆菌菌体为前体,采用一步水热法合成系列N-CQDs。通过透射电镜(TEM)、傅里叶红外光谱仪(FT-IR)和X射线衍射仪(XRD)等手段对N-CQDs的形貌和结构进行表征,并测试N-CQDs对自由基的清除能力,以期为缓解植物盐胁迫提供一种有效的纳米材料应用。

1 实验部分

1.1 细菌培养条件

本研究选用的胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus LT1906,P.m.)菌株保存于太原理工大学生物医学工程系实验室。采用无菌液体培养基(蔗糖10 g、硫酸铵0.5 g、K2HPO4 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、FeCl3 0.005 g,H2O 1 L,pH=7.2)进行培养,根据蔗糖与硫酸铵的质量设置3组碳氮比,分别为10∶0(无氮对照组)、10∶0.5和10∶5,将菌种接种于100 mL锥形瓶中,置于30℃恒温培养箱中,在180 r/min的条件下连续培养36 h获得菌液,并测定OD600。

1.2 氮掺杂碳量子点的制备方法

采用一步水热法合成N-CQDs,具体制备流程如下:菌液在4℃离心机中以5 000 r/min离心5 min收集菌体,弃上清液,用去离子水洗涤3次后重悬于10 mL去离子水中,再将其转移至100 mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜中,于180℃下水热反应12 h,经0.22 μm微孔滤膜过滤去除杂质,获得均质碳量子点溶液,于4℃避光保存。不同碳氮比培养的菌体合成的N-CQDs分别命名为N0-CQDs、N0.5-CQDs和N5-CQDs。

1.3 氮掺杂碳量子点的表征方法

采用JEM-2100F型TEM对N-CQDs的形态特征进行表征,并利用高分辨透射电子显微镜(HRTEM)获取高分辨率图像。采用DX-2700BH型XRD对N-CQDs的晶体结构进行表征。采用布鲁克ALPHA型FT-IR以及ESCALAB 250XI型XPS分析N-CQDs的表面官能团和元素组成。

1.4 体外自由基清除能力的测定

1.4.1 $\cdot \mathrm{O}_{2}^{-}$清除能力

参照苏凡等[11]方法测定$\cdot \mathrm{O}_{2}^{-}$清除率。将蛋氨酸(13 mmol/L,0.5 mL)、氯化硝基四氮唑蓝(75 mmol/L,0.5 mL)、核黄素(20 μmol/L,0.5 mL)、0.5 mL不同浓度的N-CQDs和2.5 mL PBS缓冲液(pH=7.8,50 mmol/L)混合均匀,以氯化硝基四氮唑蓝(Nitrotetrazolium blue chloride,NBT)为探针测定$\cdot \mathrm{O}_{2}^{-}$清除率。然后用12 W的照明管照射混合物10 min,于560 nm处测定吸光度。

1.4.2 ·OH清除活性

羟基自由基(·OH)清除活性参照Wang等[12]方法并作适当优化。首先,由FeSO4(1.8 mmol/L)和H2O2(5 mmol/L)反应生成·OH,10 min后,将水杨酸(1.8 mmol/L)和1.0 mL不同浓度的N-CQDs加入上述混合物中,30 min后测定510 nm处的吸光度。

1.4.3 DPPH·清除活性

DPPH·的清除活性根据Thaipong等[13]方法进行测量。将0.5 mL不同浓度的N-CQDs样品分别与2.5 mL DPPH(100 μM)乙醇溶液混合,摇匀,室温避光放置30 min,测定517 nm处吸光度。
$\cdot \mathrm{O}_{2}^{-}$、·OH和DPPH自由基清除率计算公式如下:
清 除 率 ( % ) = ( 1 - A i / A 0 ) × 100 %
式中,A0为空白对照组吸光度;Ai为不同样品溶液的吸光度。

1.5 生长条件与胁迫处理

烟草种子经75%的乙醇溶液消毒1 min、2.6%次氯酸钠消毒10 min,用去离子水冲洗3次,25℃黑暗萌发2 d后,发芽后幼苗转移至蛭石与珍珠岩(1∶1)混合基质,然后转入光照培养(温度25℃,光强度160 μE·m-2·s-1,光周期16 h/8 h,相对湿度60%),生长30 d。
在进行胁迫处理时,选取生长一致的烟草叶片分为4组。其中3组分别用200 mmol/L NaCl、1 mg/mL N-CQDs、200 mmol/L NaCl和1 mg/mL N-CQDs的混合溶液进行处理,另外1组未处理的幼苗作为对照组(CK)。所有实验进行3次重复,分别处理24 h后取样,然后测定其理化参数。

1.6 生理指标测定

取0.2 g烟草叶片,用5 mL预冷的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L Na2HPO4,0.05 mol/L K2HPO4,pH=7.0)研磨,3 000 r/min离心5 min,取上清液为粗酶液[14]。丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid,TBA)比色法,H2O2含量通过测量过氧化钛络合物在410 nm处的吸光度来确定[14]。根据Beauchamp等[15]方法测量超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性。通过测量H2O2的消耗来测定过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性[16]。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和抗坏血酸(Ascorbic acid,ASA)分别根据Hissin等[17]和Arakawa等[18]的方法进行测定。

1.7 叶片过氧化氢组织化学染色

烟草叶片放入含有适量1%二氨基联苯(Diaminobenzidine,DAB)溶液的培养皿中,于28℃下避光保存8 h,蒸馏水冲洗3次,放入无水乙醇中,于80℃水浴中恒温24 h,使叶片脱色,再次更换无水乙醇,置4℃冰箱保存后观察并拍照。

1.8 数据处理

所有数据均采用3个重复的平均值,差异显著性分析采用SPSS Statistics 20.0软件进行Duncan检验,不同大小写字母表示各组差异显著(p<0.05)。然后用Origin 9.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 碳氮比对菌体生物量的影响

图1显示碳氮比为10∶0时,菌液浓度OD600为0.05,菌体鲜重为2.19 g/L,当碳氮比为10∶0.5时,OD600值上升至0.4,菌体鲜重增加至10.35 g/L,而高氮组10∶5中菌体虽保持增殖能力,但生物量比 10∶0.5组显著下降,这与胞内碳氮代谢失衡相关,进而导致生物量减少。

2.2 碳氮比对N-CQDs结构特征的影响

以胶质类芽孢杆菌菌体为前体制备N0-CQDs、N0.5-CQDs和N5-CQDs的形貌和结构表征如图2(a)~(c)所示。TEM结果显示3种N-CQDs分散性均好,无团聚现象。HRTEM显示3种N-CQDs表面均存在明显晶格条纹,晶格间距为0.21 nm,这与石墨(100)的晶面间距相一致[19]。由图2(d)~(f)可知,N0-CQDs和N0.5-CQDs的平均粒径分别为(1.51±0.35)nm和(1.54±0.38)nm,而N5-CQDs的粒径最大,为(3.03±0.81)nm,在C∶N=10∶5下菌体表面形成高浓度氮环境,部分氮原子嵌入碳骨架内部,通过化学键改变碳核长,导致粒径增大[20]。
通过XRD分析3种N-CQDs的晶相结构。如图3(a)所示,3种N-CQDs在2θ为20~25°出现一个较宽的特征衍射峰,对应于无定形碳结构[21]。XRD结果与HRTEM结果一致。N-CQDs的表面化学键和官能团通过FT-IR光谱分析。由图3(b)可知,3种N-CQDs在3 600~3 100 cm-1范围内均呈现O—H宽特征峰[22],1 671 cm-1的吸收带对应于C══O伸缩振动[23],1 629 cm-1处的吸收峰对应于C══C伸缩振动[24],1 381 cm-1处的吸收峰来自于C—N伸缩振动[25]。其中,N5-CQDs和N0.5-CQDs的C══O和C—N振动峰强度显著高于N0-CQDs,可能是氮源缺失限制含氮官能团的生物合成,使C══O和C—N振动峰强度降低[26]。
由图4(a)可知,N0-CQDs未检测出N元素,而N5-CQDs和N0.5-CQDs的N含量分别为9.29%和9.24%,未见显著增多,表明胶质类芽孢杆菌对N转化具有极限性,N在碳骨架中掺杂已达饱和;而N5-CQDs中C含量比N0-CQDs和N0.5-CQDs明显减少而氧元素同步升高,归因于氮掺杂引发的结构重构加速表面氧化过程[27]。由图4(b)可知,N5-CQDs和N0.5-CQDs在401.3~401.5 eV处对应石墨氮峰,在399.7~399.9 eV处为吡咯氮峰[28]。图4(c)显示3种N-CQDs的C 1s谱分别为288.2~288.8 eV(C══O)、286.2~286.3 eV(C—O)和284.8 eV(C—C/C══C)[29]。图4(d)所示,3种N-CQDs的O 1s谱中均包含位于533.2~533.4 eV(C—O)和531.7~531.9 eV(C══O)的两个特征峰[29]。

2.3 碳氮比对N-CQDs清除ROS能力的影响

如图5(a)所示,经多项式拟合计算可知,N0.5-CQDs对$\cdot \mathrm{O}_{2}^{-}$半数抑制浓度IC50为0.86 mg/mL,显著低于N5-CQDs和N0-CQDs。图5(b)显示3种N-CQDs的对·OH的清除率具有显著的剂量依赖性,且N0.5-CQDs的IC50为1.72 mg/mL显著低于N5-CQDs和N0-CQDs。图5(c)结果显示N5-CQDs与N0.5-CQDs的DPPH·清除率IC50分别为0.87 mg/mL和0.71 mg/mL,均显著低于N0-CQDs。以上结果表明N0.5-CQDs表现出最优自由基清除能力,当N0.5-CQDs浓度为2 mg/mL时,$\cdot \mathrm{O}_{2}^{-}$、·OH和DPPH·的清除率分别为76.3%、60.9%和79.3%。这表明氮掺杂能优化N0.5-CQDs的电子结构与反应活性,增强自由基清除能力。本研究的N0.5-CQDs与Wang等[30]以氢氧化铵为氮源合成的N-Ti3C2量子点类似,其自由基清除能力显著优于Ti3C2。

2.4 N0.5-CQDs对NaCl胁迫下烟草氧化损伤的影响

如图6(a)所示,DAB组织染色显示,与对照组相比,NaCl处理组烟草叶片的棕色沉淀显著增多,N0.5-CQDs+NaCl处理使ROS的积累显著减少。如图6(b)所示,与对照组相比,NaCl处理烟草叶片后H2O2含量为2.43 mmol/g FW,N0.5-CQDs+NaCl处理组可缓解NaCl胁迫引起的H2O2含量升高,这也与DAB染色结果一致。同时MDA含量的变化趋势与H2O2一致[图6(c)]。Qiao等[31]发现,SlTpx过表达的烟草在150 mmol/L NaCl处理下,H2O2积累显著减少,MDA含量也明显下降。

2.5 N0.5-CQDs对NaCl胁迫下烟草抗氧化系统的影响

如图7(a)所示,N0.5-CQDs处理组使SOD活性较对照组显著提高27.73%,而NaCl处理组的SOD活性较对照组降低24.1%,N0.5-CQDs+NaCl处理组的SOD活性较NaCl处理组显著提高,显著缓解NaCl诱导的活性降低。CAT活性的变化趋势与SOD一致[图7(b)]。Li等[32]发现Cu/N-CDs激活黄瓜幼苗SOD和CAT活性缓解盐胁迫引起的氧化损伤,进而增强植株抗逆性。图7(c)、(d)显示,与对照组相比,NaCl处理组的ASA和GSH含量分别显著降低17.54%和24.60%,这与NaCl胁迫诱导ROS积累并消耗抗氧化物的机制一致[33],而NaCl+ N0.5-CQDs处理可缓解这种降低,由此表明,N-CQDs可缓解盐胁迫对抗氧化物的破坏,维持植物氧化还原体系的稳态[33]。

3 结论

本研究利用胶质类芽孢杆菌制备氮掺杂碳量子点(N-CQDs),不同碳氮比显著影响菌体生物量及代谢产物组成,从而调控N-CQDs的N掺杂程度、粒径大小与表面官能团分布,N0.5-CQDs具备最优的自由基清除能力。在NaCl胁迫下,N0.5-CQDs处理后的烟草叶片中,H2O2和MDA含量明显减少,DAB染色叶片棕色沉淀显著减轻,表明ROS积累受到有效抑制,同时N0.5-CQDs处理可显著增强SOD与CAT酶活性,减少GSH和ASA抗氧化物的过度消耗,这些作用协同维持植物体氧化还原体系的稳态。

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