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可酶解羧甲基壳聚糖-聚氨酯农药缓释微球的研制

雷萌萌 ,  孙玙璠 ,  陈舒怡 ,  李东 ,  丁师杰 ,  胡涛 ,  王志辉

现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (S2) : 149 -154.

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现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (S2) : 149-154. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.S2.027
科研与开发

可酶解羧甲基壳聚糖-聚氨酯农药缓释微球的研制

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Preparation and research of enzymatically degradable carboxymethyl chitosan based polyurethane sustained-release microspheres for pesticides

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摘要

为解决高效氯氰菊酯在自然环境中易分解、流失的问题,以O/W型Pickering乳液为模板,采用界面聚合法合成可酶解的羧甲基壳聚糖-聚氨酯负载高效氯氰菊酯微球。通过改变羧甲基壳聚糖溶液的pH及其投放量、高效氯氰菊酯投放量等因素,优化制备方案。采用红外光谱和扫描电镜对所制得的载药微球结构及形貌进行了表征;采用紫外-可见分光光度计测定载药微球的包封率和载药量;研究了载药微球在50%乙醇溶液中的药物释放行为以及药物释放机理。研究表明,该载药微球可以分别被溶菌酶和纤维素酶降解。

Abstract

Beta-cypermethrin is easy to decompose and run off in the natural environment.In order to solve this problem,the enzymatically degradable carboxymethyl chitosan based polyurethane beta-cypermethrin-loading microspheres are synthesized via interfacial polymerization using O/W Pickering emulsion as template.The preparation scheme is optimized through changing the pH of carboxymethyl chitosan solution,the dosage of carboxymethyl chitosan,and the dosage of beta-cypermethrin.The structure and morphology of the beta-cypermethrin-loading microspheres are characterized by means of FT-IR and SEM,and the beta-cypermethrin loading amount and encapsulation efficiency of the microspheres are evaluated via UV-Vis.The sustained release performance and mechanism of the microspheres in 50% ethanol solution are determined.It is clarified that this beta-cypermethrin-loading microspheres can be degraded by lysozyme and cellulase,respectively.

Graphical abstract

关键词

羧甲基壳聚糖 / 农药缓释微球 / 高效氯氰菊酯 / Pickering乳液 / 聚氨酯

Key words

carboxymethyl chitosan / sustained-release microspheres for pesticides / beta-cypermethrin / Pickering emulsion / polyurethane

Author summay

雷萌萌(1997-),女,硕士生,研究方向农药缓释剂,

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雷萌萌,孙玙璠,陈舒怡,李东,丁师杰,胡涛,王志辉. 可酶解羧甲基壳聚糖-聚氨酯农药缓释微球的研制[J]. 现代化工, 2025, 45(S2): 149-154 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.S2.027

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高效氯氰菊酯(BC)是广谱杀虫剂[1],通过触杀和胃杀的方式发挥作用[2],对多种农业害虫具有显著的杀虫效果。由于其非内吸性质以及易光解和在土壤中易于分解的特性[3],导致在自然条件下,该农药容易受到光照和雨水冲刷的影响,造成药物流失和有效剂量迅速下降[4-5]。为了提高高效氯氰菊酯利用率并解决其“高施低效”[6]和流失引发的农业面源污染问题,本研究拟采用可天然降解的载体材料对其进行负载制备农药缓释剂,提高其利用率的同时减少载体材料对环境的二次污染问题。
聚氨酯微球(PMC)因其优异的成膜性[7]和化学稳定性[8],被广泛应用于农药的负载。然而,PMC结构紧密且难以生物降解的特性限制了其在农药缓释剂方面的应用。为了解决这一问题,研究人员将PMC与其他材料复合。Pang等[9]将可生物降解的木质素引入到PMC中,不仅提升了降解性,还增强了抗紫外光性能。Zhang等[10]以木质素磺酸钠、蓖麻油和异佛尔酮二异氰酸酯为原料制备了蓖麻油基水性聚氨酯/木质素磺酸钠复合膜,并对其疏水性能、力学性能、紫外线吸收性能和热稳定性能等进行了研究。范燕香等[11]制备了羧甲基壳聚糖-蓖麻油基聚氨酯微球,通过分子自组装法负载阿维菌素,研究了载药微球的抗紫外性能、缓释性能和包封率等。
羧甲基壳聚糖(CMCS)是可以生物降解的天然高分子材料[12],可溶于水[13],表面具有丰富的羧基和氨基,是pH敏感性材料[14],可以作为乳化剂。Kalliola等[15]研究发现,乳液稳定性随CMCS溶液的pH改变。
本研究通过调节CMCS溶液的pH,制备稳定的Pickering乳液,并以此为模板,通过界面聚合法制备负载高效氯氰菊酯的羧甲基壳聚糖-聚氨酯载药微球,并对其形貌和结构进行表征,研究其释药行为。
目前关于农药缓释剂生物降解性能的研究比较少,本研究考虑使用自然环境中广泛存在的溶菌酶和纤维素酶分别对所制备载药微球的酶降解行为进行研究,从而对其生物降解性能进行判断。溶菌酶广泛存在于自然界内,可以从植物、动物、微生物中提取,价格便宜[16]。溶菌酶通过内切作用切断CMCS的β-1,4糖苷键来降解CMCS,如图1所示[17]。纤维素酶在自然界的生物体内广泛存在,它也可以通过内切作用切断壳聚糖的β-1,4糖苷键来降解壳聚糖[18]。

1 材料与方法

1.1 原料

高效氯氰菊酯,有效成分含量为95.2%,湖北富瑞达化工科技有限公司生产;乙二胺(EDA),99%,上海萨恩化学技术有限公司生产;MDI,98%,阿拉丁试剂有限公司生产;CMCS,罗恩试剂,脱乙酰度大于90%,取代度90%,分子量240 kDa;纤维素酶,酶活力50 U/mg,上海麦克林生化科技有限公司提供;溶菌酶,酶活力10 000 U/m,上海伯奥生物科技有限公司提供;聚乙烯醇(PVA)105型,醇解度为98%~99%;甲苯和无水乙醇均为分析纯;实验室用水均为去离子水。

1.2 载药微球的制备

以O/W型Pickering乳液为模板,采用界面聚合法合成羧甲基壳聚糖-聚氨酯负载高效氯氰菊酯微球(BC@CPMC)。
将一定量的BC和0.625 g的MDI溶解于9 mL的甲苯中作为油相;将一定量的CMCS溶解于 40 mL的去离子水中,调节pH作为水相;将水油两相混合,手摇3 min,形成O/W型Pickering乳液。
反应在50℃水浴锅中密闭进行,搅拌转速为100 r/min。将上述制备的O/W型Pickering乳液立即转移到50 mL 0.1%PVA溶液中。通过恒流泵控制在1 h内滴加完5 mL的EDA溶液(0.27 mL的EDA溶于5 mL去离子水中),继续反应5 h,离心得到固体样品,使用去离子水清洗两遍,冷冻干燥,制得BC@CPMC载药微球样品。制备流程图如图2所示,反应原理如图3所示。
聚氨酯负载高效氯氰菊酯微球(BC@PMC)的制备过程与BC@CPMC相似,不同之处在于用 40 mL的0.1% PVA溶液代替40 mL的CMCS溶液作为水相。

1.3 形貌与结构表征

采用日本日立公司的S-3000N扫描电子显微镜检测载药微球的形貌;采用傅里叶红外光谱仪ATR附件对样品进行结构表征,ATR晶体材料为锗,分辨率为4 cm-1,扫描次数为64次,入射角度为45°,反射次数为1次,扫描范围650~4 000 cm-1。

1.4 载药量和包封率的测定

将10 mg的载药微球进行充分研磨,溶于10 mL的50%乙醇中,磁力搅拌过夜,使载药微球中的原药能够完全溶解在50%乙醇中。使用紫外分光光度计根据BC在50%乙醇中的标准曲线计算BC的含量,如式(1)。根据式(2)、式(3)分别计算载药微球的载药量(DL)和包封率(EE)[19]。其中WF表示载药微球内所含BC的质量,WS表示载药微球的总质量,WT表示制备载药微球时投放BC的总质量,单位均为mg。
$y=0.0049 x-0.0051, R^{2}=0.9989$
D L = ( W F / W S ) × 100 %
E E = ( W F / W T ) × 100 %

1.5 缓释性能的测定

称取一定量载药微球样品,置于处理好的透析袋中,药物释放环境是200 mL的50%乙醇溶液,透析袋内外体积比为3∶37,转速为120 r/min,定时取透析袋外样品溶液10 mL,再补10 mL的50%乙醇溶液,保证药物释放环境的溶液体积不变。使用紫外分光光度计进行测试,根据式(4)计算BC累积释放率Q[20]。每组样品测试3次,取平均值。绘制载药微球的药物释放曲线图,并用动力模型分析其释放动力学。
Q ( % ) = [ ( V × C n ⊕ V i × ∑ i = 1 n - 1 C i ) / M ] × 100 %
其中,V为药物释放体系中的溶剂总体积,L;Vi为每次取样的体积,L;Cn为第n次测得的溶液浓度,mg/L;Ci为第i(i<n)次测得的溶液浓度,mg/L;M为样品中BC的总质量,mg。

1.6 酶解性能的测定

在10 mL pH为6.0的水溶液中加入0.02 g的载药微球样品和0.007 g的纤维素酶,使用水浴恒温振荡器,在40℃、120 r/min的条件下往复振荡 12 h。在样品溶液中加入10 mL乙醇,将温度保持在25℃,以120 r/min往复震荡1 h,计算BC累积释放率。
使用0.1 mol/L的乙酸和0.2 mol/L的乙酸钠作缓冲液,称取0.02 g的载药微球样品,加到溶有0.007 g溶酶菌的10 mL缓冲液中,然后使用水浴恒温振荡器在25℃下以120 r/min往复振荡12 h。最后加入10 mL乙醇,继续震荡1 h。计算BC累积释放率。

2 结果与分析

2.1 制备工艺分析与优化

通过固定MDI、EDA、PVA用量(质量和体积一定),改变CMCS溶液pH、CMCS投放量、BC投放量等因素,以载药量和包封率作为评价标准,优化微球制备工艺。不同条件制备的载药微球以及对应的包封率和载药量如表1所示。

2.1.1 CMCS的pH对载药微球包封率和载药量的影响

CMCS是pH敏感材料,可用作Pickering乳化剂稳定乳液。分别以pH为6、6.5、7、7.5的CMCS溶液作水相,溶有BC的甲苯溶液作油相,水油两相混合,手摇3 min形成乳液,静置24 h,结果如图4所示。在静置过程中发现乳液pH为6.5时,白色乳液最多,乳液最稳定[15]。
如表1中A1、A2、A3、A4的数据所示,随着pH的增加,BC@CPMC的包封率和载药量先增加再下降。当pH为6.5时,BC@CPMC的包封率和载药量最高。说明当其他制备条件不变,CMCS溶液pH为6.5时,乳液最稳定,制备的载药微球包封率和载药量也最高。这是因为pH在6左右时CMCS在水/油界面形成胶体颗粒,能够稳定乳液[15]。因而在以下实验中均选择pH为6.5的CMCS溶液作为水相制备Pickering乳液,并以此为模板制备载药微球。

2.1.2 CMCS投放量对载药微球包封率和载药量的影响

CMCS既作乳化剂又作载体原料,其投放量对载药微球的包封率和载药量有影响。由表1中A2、A5、A6、A7的数据所示,随着CMCS投放量增加,载药微球包封率和载药量的整体趋势是先增加再下降。这是因为CMCS作为乳化剂,其量增多,在油相液滴表面覆盖率增加,所形成的胶束稳定性增加,乳液更稳定,载药微球包封率和载药量增高。但是当CMCS达到一定量时,载体总量增加,投放的原药量不变,载药微球载药量和包封率下降。

2.1.3 BC投放量对载药微球包封率和载药量的影响

由表1中A6、A8、A9、A10、A11数据所示,当载体总量不变时,随着BC量的增加,载药微球包封率和载药量的整体趋势是先增加后下降。这是因为载体总量不变,能够包裹的药量是有限的。当BC量过高,超过了载体包裹能力,包封率和载药量下降。当pH为6.5、BC投放量为0.3 g、CMCS投放量为0.37 g时,载药微球的包封率和载药量最高,分别是84.37%±0.47%和19.74%±0.11%。

2.2 微球形貌分析

同样制备条件下,PMC、BC@PMC、CPMC和BC@CPMC扫描电镜图如图5,其制备条件分别对应着表1中A14、A13、A12和A6。对比图5(a)与图5(b)可以发现,聚氨酯负载高效氯氰菊酯会使得球形样貌变得不规整,且表面出现粗糙的凸点,这可能是溶剂挥发导致的。由图5(a)和图5(c)对比可以发现,PMC微球表面有明显的絮状,而加入CMCS后CPMC空白微球表面比较光滑。对比图5(b)与图5(d)可以发现,同样是载药微球,BC@CPMC比BC@PMC微球的表面更加光滑,且球形样貌更加饱满,这可能是因为加入CMCS之后乳液更稳定,进行界面聚合时,CMCS作为刚性材料与MDI反应生成复合载体,能够改善微球的外貌,使得球形变得光滑、饱满。这与表1中A6和A13的数据相印证,当其他制备条件一致时,加入0.37 g的CMCS,提高了乳液的稳定性,改善了微球凹陷状况,所得BC@CPMC形貌较好,载药量和包封率明显提高。

2.3 红外谱图分析

图6是PMC、BC@PMC、BC@CPMC、CPMC和BC的红外图谱。由图6发现,PMC在3 390、2 276、1 410 cm-1处出现特征峰。其中,3 390 cm-1是N—H伸缩振动峰,2 276 cm-1是异氰酸酯基团(—N══C══O)的特征吸收峰,说明MDI没有完全反应[11],1 410 cm-1是异氰脲酸酯(三聚体)中的C══O吸收峰。对比PMC和BC@PMC谱线可以发现,加入BC原药后,PMC特征峰的位置没有发生明显变化,在1 739 cm-1处出现BC的特征峰,说明BC成功负载到载体上,且没改变载体结构。对比PMC和CPMC谱线发现,加入CMCS后,PMC的特征峰位置没有发生改变,但是2 276 cm-1处的特征峰峰强明显减弱,可定性说明CMCS与MDI发生了反应。对比PMC和BC@CPMC谱线发现,加入CMCS和BC后,PMC的特征峰位置没有发生改变,2 276 cm-1处的特征峰峰强明显减弱,1 739 cm-1处出现BC的特征峰,说明CMCS与MDI反应,但是未改变反应产物的结构,BC成功负载到载体上。
在2 276 cm-1处的峰是异氰酸酯基团(—N══C══O)的特征吸收峰,是未反应物的峰;1 410 cm-1是异氰脲酸酯(三聚体)中C══O的特征吸收峰,是产物的特征峰。可通过式(5)计算MDI的反应率,对比PMC和CPMC中MDI的反应率,进一步定量判断CMCS与MDI是否反应。
V ( % ) = [ X / ( X + Y ) ] × 100 %
其中,V为反应率,是原料MDI的反应程度;X为产物的峰高,即1 410 cm-1处的峰高(吸光度);Y为未反应物的峰高,即2 276 cm-1处的峰高(吸光度)。
因为透过率与样品的浓度不成正比,只能进行定性分析,所以将图6中PMC和CPMC样品的红外光谱转成吸光度,进行定量分析,如图7所示。图中PMC和CPMC对应表1中样品A14和A12,二者制备条件区别为加与不加CMCS。测得2 276 cm-1处的峰高和1 410 cm-1处的峰高,经计算得到CPMC的MDI反应率为73.91%,PMC的MDI反应率为44.91%,说明加入CMCS后MDI反应率增加,CMCS与MDI确实发生了反应。这也与扫描电镜图的结论相印证,CMCS的加入增强了乳液稳定性的同时,也作为刚性材料与MDI反应改善了微球的形貌。

2.4 药物缓释行为研究

图8(a)是BC@PMC和BC@CPMC在50%乙醇溶液中的BC累积释放率曲线图。如图8(a)所示,BC@PMC和BC@CPMC微球前期BC释放略快,后期释放较慢。BC@CPMC微球在87.2 h累积释放率约为50%,336 h时累积释放率达到76.88%±0.27%。BC@PMC微球在77.5 h累积释放率约为50%,312 h累积释放率达到81.01%±0.28%。在62 h后,BC@CPMC微球比BC@PMC微球的BC累积释放速率明显降低,说明CMCS的加入改变了载药微球的药物释放特性,延缓了药物释放速率,对提高载药微球缓释效果有一定作用。
使用Ritger-Peppas模型对BC@CPMC和BC@PMC的药物累积释放率进行拟合,其中t为时间,单位是h;Mt/M∞为t时刻药物的累积释放率,单位是%;n为扩散指数,是ln(Mt/M∞)与lnt线性拟合的斜率,由n值大小判断扩散机理,结果如图8(b)所示,发现线性回归系数大于0.95,ln(Mt/M∞)与lnt线性相关,BC@CPMC和BC@PMC的n值分别是0.659和0.679,可以确定BC@CPMC和BC@PMC的释放机理均为药物扩散和骨架溶蚀的结合。

2.5 BC@CPMC的酶降解

采用含有0.47 g的CMCS和0.3 g的BC制备的BC@CPMC样品,也就是表1中A7样品,分别用纤维素酶和溶菌酶进行处理,并且使用不加酶的样品为对照组,通过对比BC累积释放率,判断酶是否能够降解BC@CPMC,见表2。对比释放率发现,添加纤维素酶的B1组BC累积释放率比B2组高出6%左右,说明纤维素酶在40℃的环境下对BC@CPMC有降解效果;添加溶菌酶的B3组BC累积释放率比B4组高出2%左右,说明溶菌酶在25℃的环境下可以降解BC@CPMC。

3 结论

研究表明,CMCS可与MDI反应,成功制备了出BC@CPMC。CMCS既作乳化剂,又作原料与MDI进行界面聚合反应形成载药微球。当其他条件一定时,CMCS溶液pH为6.5、CMCS投放量为0.37 g、BC投放量为0.3 g时,载药微球的包封率和载药量达到最高,分别为84.37%±0.47%和19.74%±0.11%。BC@CPMC和BC@PMC在50%乙醇溶液中的BC释放呈现先快后慢的趋势,整个药物释放过程没有明显的突释,其释放机制属于药物扩散和骨架溶蚀相结合。BC@CPMC在一定条件下可以分别被溶菌酶和纤维素酶降解,表明该载药微球可以在自然环境中降解。

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