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PEG 2000-K2HPO4双水相萃取安赛蜜的研究

蔡珍珍 ,  张旭男 ,  宗薇

现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (S1) : 401 -406.

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现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (S1) : 401-406. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.S1.073
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PEG 2000-K2HPO4双水相萃取安赛蜜的研究

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Study on extraction of acesulfame K by PEG 2000-K2HPO4 aqueous two-phase system

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摘要

建立了聚乙二醇(PEG)2000-磷酸氢二钾双水相体系萃取人工合成甜味剂安赛蜜的方法。首先采用浊点滴定法对不同分子量的PEG与磷酸氢二钾的成相能力进行对比,确定成相组分;其次考察了成相物质对安赛蜜吸光度的影响,利用紫外分光光度计检测PEG 2000-磷酸氢二钾双水相体系对安赛蜜的萃取能力,在2~20 μg/mL的范围内线性关系良好,相关系数达0.999,方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.33、1.1 μg/mL。对自来水样中人工合成甜味剂安赛蜜的加标回收率可达92.4%~95.0%,RSD为1.4%~1.7%。该方法简单、快速、易于操作,为食品及环境中安赛蜜的检测提供了理论基础。

Abstract

A method is established for the extraction of synthetic acesulfame K sweetener by an aqueous two-phase system consisting of polyethylene glycol (PEG) 2000-dipotassium hydrogen phosphate.Firstly,the cloud point titration method is employed to compare the phase formation ability of PEG with different relative molecular weight and dipotassium hydrogen phosphate to determine the phase composition.Secondly,the influence of phase forming substances on the absorbance of acesulfame K is evaluated.The extraction capacity of PEG 2000-dipotassium hydrogen phosphate aqueous two-phase system is detected by means of ultraviolet spectrophotometer.It is verified that there is a good linear relationship in the range of 2-20 μg·mL-1,with a correlation coefficient of 0.999.The limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) are 0.33 μg·mL-1 and 1.1 μg·mL-1,respectively.The recovery rates of acesulfame K in water samples are 92.4%-95.0% and RSD is 1.4%-1.7%.The method is simple,rapid and easy to operate,which provides a theoretical basis for the detection of acesulfame K in foodstuffs and in the environment.

Graphical abstract

关键词

双水相体系 / 紫外分光光度计 / 安赛蜜 / 磷酸氢二钾 / 聚乙二醇

Key words

aqueous two-phase system / ultraviolet visible spectrophotometer / acesulfame K / dipotassium phosphate / polyethylene glycol

Author summay

蔡珍珍(1998-),女,硕士生,研究方向为液相萃取,。

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蔡珍珍,张旭男,宗薇. PEG 2000-K2HPO4双水相萃取安赛蜜的研究[J]. 现代化工, 2025, 45(S1): 401-406 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.S1.073

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甜味剂是一类可以提升食品甜味和口感的添加剂,按来源可以分为天然类和人工合成类甜味剂,相比于山梨糖醇、麦芽糖醇等天然类甜味剂,人工合成类甜味剂如安赛蜜、阿斯巴甜等具有甜度高、热量低、价格低廉、不易发生龋齿等优点,在食品生产中应用极其广泛[1]。以前,人们常用人造甜味剂治疗肥胖和糖尿病,但最近人们发现人造甜味剂会影响人体和动物肠道中的葡萄糖吸收以及胰岛素和肠促胰岛素的分泌,此外人造甜味剂在肥胖、心血管疾病和死亡率方面也有副作用[2-3]。
安赛蜜是第4代合成甜味剂,化学名称为乙酰磺胺酸钾,热稳定性较强,在体内不代谢、不蓄积,可以单独使用,也可以与其他甜味剂如阿斯巴甜混合使用,并产生很强烈的协同效应,可广泛用于固体饮料、酱菜类、蜜饯及餐桌用甜味料等各种食品,被认为是最有前途的甜味剂之一[4-5]。近年来,人工合成甜味剂的安全性越来越引起人们的重视,长期过量食用磺胺类人工合成甜味剂超标的食品会对人体的健康造成危害[6],我国食品安全标准中对各种类型食品中安赛蜜的最大使用量进行了严格的规定,但仍然存在安赛蜜使用超标的现象。此外,安赛蜜投放至环境中也可能成为污染物对生态环境造成负面影响[7],因此对安赛蜜的检测有着重要意义。
双水相体系(ATPS)是一种基于两种水溶液混合物的液-液分离方法,具有操作条件温和、生物相容性好、操作简单迅速、对环境友好、易于放大等优点[8-9]。当将目标化合物加入到双水相体系后,目标物因为受体积排斥力、疏水作用和静电相互作用等而被分配到双水相的其中一相中[10]。自双水相体系的实际应用被发现以来,酶[11]、蛋白质[12-14]、核酸[15]、病毒[16]等生物分子的纯化一直是双水相体系的优势。目前,双水相体系已被证明具有从复杂的基质中对目标化合物进行高效浓缩、富集、回收和纯化的能力[17],并且已经成功地应用于食品中农药、兽药残留的检测[18-19]、贵金属的分离[20]、活性物质的提取[21-22]等方面,因此双水相体系有望成为一种有效的甜味剂检测方法。
本文以聚乙二醇(PEG)和磷酸氢二钾(K2HPO4)为原料,首先以浊点滴定法结合经典的Merchuk方程拟合分析,探究了不同分子量的PEG与K2HPO4的成相能力。随后利用PEG 2000与K2HPO4形成双水相体系对人造甜味剂安赛蜜进行萃取,以紫外-可见分光光度法检测该体系对安赛蜜的萃取能力,并确定PEG 2000-K2HPO4双水相体系萃取浓缩安赛蜜的最佳条件,并进行实际水样的检测和分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TU-1901双光束紫外-可见分光光度计,上海沪粤科学仪器有限公司;FA2004C万分之一电子天平(0.001 g)、JC-QX-6.2L数显超声波清洗机,青岛聚创环保设备有限公司;TG16G台式高速医用离心机,盐城市凯特实验仪器有限公司;WYA-2W阿贝折射仪,上海仪电物理光学仪器有限公司;DDS-307电导率仪,上海仪电科学仪器股份有限公司;SH-3C数显加热磁力搅拌器,天津市泰斯特仪器有限公司;P230液相色谱仪,大连依利特仪器有限公司。
安赛蜜、PEG(分子量2 000、8 000、20 000),上海麦克林生化科技股份有限公司;无水K2HPO4,天津市福晨化学试剂厂;0.22 μm水系滤膜,天津市领航实验设备股份有限公司;实验用水均为去离子水。

1.2 实验方法

1.2.1 相图及系线的确定

(1)相图
相图是表征ATPS组成与溶液温度、pH等参数之间关系的重要工具,还可以预测两种或多种不同成分分别在ATPS中的质量分数。采用浊点滴定法[23-24]分别绘制PEG分子量为2 000、8 000和20 000的PEG-K2HPO4双水相体系的双节线相图。用万分之一电子天平精确称量一定质量(ms)的K2HPO4于西林瓶中,加入一定质量(mwi)的去离子水溶解,使用加热磁力搅拌器控制体系温度为25℃。向体系中逐滴加入PEG,充分摇晃或采用磁力搅拌使其混合充分,直至溶液恰好由澄清变为浑浊,记录加入PEG的质量(mpi);然后再向体系中加入一定质量(mwi)去离子水,体系由浑浊变为澄清,再逐滴加入PEG使体系恰好浑浊,记录加入PEG的质量(mpi)。按照如上步骤反复操作,计算各次浑浊时K2HPO4的质量分数(wsi)和PEG的质量分数(wpi),计算公式[21]如下(其中,i=1,2,3,…,n):
w s i / % = [ m s / ( m s + ∑ m w i + ∑ m p i ) ] × 100
w p i / % = [ ∑ m p i / ( m s + ∑ m w i + ∑ m p i ) ] × 100
分别以wsi和wpi为横、纵坐标利用OriginPro 2022作图,即可得到PEG-K2HPO4双水相的双节线图。
分别用分子量为2 000、8 000、20 000的PEG采用浊点滴定法测定PEG-K2HPO4体系在25℃时的双节线数据,由数据绘制双节线相图,再由Merchuk方程拟合,拟合方程[25-26]如下:
Y = A e x p [ ( B × X 0.5 ) - ( C × X 3 ) ]
式中:Y、X分别为顶相组成和底相组成的质量分数,%;A、B、C为最小二乘回归拟合参数。
(2)系线
系线连接了位于双节曲线上的两个节点,系线长度是两相成分差异的数值度量,经常用于描述两相之间的溶质分配趋势。准确称取0.600 0 g PEG 2000和1.000 0 g K2HPO4于10 mL离心管中,用移液枪准确移取2.4 mL去离子水,涡旋使其充分溶解,经3 000 r/min离心10 min,形成PEG 2000-K2HPO4初始组成(质量分数,下同)为15%~25%的双水相体系。待分层后分别读取上相(PEG相)和下相(K2HPO4相)的体积,并称量各相质量,用阿贝折射仪和电导率仪确定上、下相中含有的PEG和K2HPO4的质量分数后,利用OriginPro 2022作图。控制体系总质量为4 g,同方法制备初始组成分别为10%~20%、20%~30%的双水相体系,并绘制各初始组成的系线图。

1.2.2 双水相萃取方法

(1)安赛蜜萃取体系的制备
精确称取安赛蜜标准品10 mg,用去离子水溶解并定容至100 mL,摇匀,超声3 min,制得100 μg/mL的安赛蜜标准溶液,于-4℃条件下保存备用。准确称取0.600 0 g PEG 2000和1.000 0 g K2HPO4于10 mL离心管中,加入安赛蜜标准溶液2.4 mL,经 3 000 r/min离心10 min,形成PEG 2000-K2HPO4初始组成为15%~25%的双水相体系。待分层后用移液枪准确移取PEG相0.5 mL适当稀释,同样方法制备PEG 2000-K2HPO4 (15%~25%)双水相体系的上相参比溶液,用于紫外-可见分光光度法安赛蜜吸光度值的检测。
(2)安赛蜜最佳萃取条件的确定
确定安赛蜜的最大吸收波长,配制与各初始组成PEG 2000-K2HPO4双水相体系相对应的安赛蜜紫外吸收标准曲线浓度梯度,安赛蜜的质量浓度为2~20 μg/mL。
固定初始组成为15%~25%、温度20℃,在不同离心时间(5、6、7、8 min)下萃取30 min,研究离心时间对安赛蜜回收率的影响。
固定萃取温度为20℃,在不同初始组成(10%~20%、15%~25%、20%~30%)下萃取30 min,研究初始组成对安赛蜜回收率的影响。
固定最佳初始组成,在不同温度(25、35、45、55℃)下萃取30 min,研究温度对安赛蜜回收率的影响,确定PEG 2000-K2HPO4双水相体系萃取浓缩安赛蜜的最佳工艺。
(3)安赛蜜回收率
在最佳条件下,进行5组平行实验,每组连续测定3次,取平均值,由标准曲线计算经双水相萃取后上相中安赛蜜的回收率和相对标准偏差(RSD),公式[27-28]如下:
Y / % = [ R K / ( R K + 1 ) ] × 100
R = V t / V b
K = ρ t / ρ b
式中:K为安赛蜜在双水相体系分配系数;R为双水相体系上下相的体积比;Y为安赛蜜在上相中的回收率,%;Vt为双水相体系上相体积,mL;Vb为双水相体系下相体积,mL;ρt为双水相系统上相安赛蜜的质量浓度,μg/mL;ρb为双水相系统下相安赛蜜的质量浓度,μg/mL。

1.2.3 样品制备

取适量自来水水样,经0.22 μm水系滤膜过滤,用于PEG 2000-K2HPO4双水相体系浓缩及检测水样中安赛蜜。

2 结果与讨论

2.1 相图及系线

由浊点滴定法结合Merchuk方程拟合的K2HPO4与PEG(分子量2 000、8 000、20 000)组成的双水相体系双节线图如图1(a)所示。
双节点曲线下方对应于单相区,双节点曲线上方为双相区,即体系可以形成互不相溶的两个水相。由图1(a)可见,在盐种类不变的情况下(K2HPO4),双相区PEG 20000>PEG 8000>PEG 2000,即PEG的分子量越大,双节点曲线的双相区也越大,所需的盐的质量越小。这可能是因为在相同温度下,随着PEG分子量的增大,PEG黏度增大、疏水作用增强、成相更容易。为方便实验操作,选用PEG 2000与K2HPO4组成双水相体系进行后续研究。
通过对各初始浓度的PEG 2000-K2HPO4双水相体系上、下相中含有的PEG和K2HPO4的质量分数进行测定,绘制了PEG 2000-K2HPO4双水相体系的系线图,如图1(b)所示。其中,TB为一条系线,S代表对应的初始组成,由图1(b)可知,系线越长,其初始相组成成分含量也越大,上相中PEG 2000和下相中K2HPO4的质量分数就越高,两相成分差异增大,相分离越完全。

2.2 安赛蜜紫外最大吸收波长的确定

通过紫外光谱扫描安赛蜜和PEG 2000-K2HPO4双水相体系,结果如图2所示。
安赛蜜在228 nm处有最大吸收,PEG 2000相在192 nm处有最大吸收,且在228 nm处几乎未产生吸收。用该双水相体系萃取安赛蜜,上相PEG 2000对安赛蜜的检测干扰可忽略不计,且安赛蜜的最大吸收波长未发生改变。故用紫外分光光度法检测PEG 2000相中的安赛蜜方法可行,安赛蜜的检测波长为228 nm。

2.3 标准曲线的绘制

按照1.2.2(1)中空白样的稀释方法,分别绘制双水相体系初始组成为10%~20%、15%~25%、20%~30%时对应PEG 2000质量浓度的安赛蜜标准曲线,目的是消除PEG 2000对安赛蜜检测的干扰。图3为标准曲线结果,得到的标准曲线线性方程及R2如表1所示。

2.4 安赛蜜最佳萃取工艺的确定

通过对PEG 2000-K2HPO4双水相体系离心时间、初始组成和萃取温度的考察,确定安赛蜜的最佳萃取工艺,结果如图4所示。

2.4.1 离心时间对安赛蜜萃取的影响

选取15%~25%的PEG 2000-K2HPO4双水相体系,准确称取0.600 0 g PEG和1.000 0 g K2HPO4和2.4 mL的安赛蜜标准溶液,控制体系总质量为 4 g、萃取温度为20℃,考察在3 000 r/min时不同离心时间(4、5、6、7、8 min)下萃取30 min安赛蜜回收率、分配系数及相比的变化,结果见图4(a)。随着离心时间的增加,该体系相比不变,PEG 2000-K2HPO4双水相体系对安赛蜜的萃取能力先增大后减小,分配系数也呈现相同的变化趋势。这可能是由于机械离心使相分离更加完全,PEG 2000相中安赛蜜也随之增多,回收率增大,但当其继续增大时,回收率基本不变,可能是PEG 2000-K2HPO4双水相体系萃取的能力达到上限,机械离心的增益效果不明显,故本实验选择6 min为安赛蜜萃取的最佳离心时间。

2.4.2 初始组成对安赛蜜萃取的影响

向双水相体系中加入安赛蜜标准溶液 2.0 mL,控制体系总质量为4 g,在离心时间为6 min、萃取温度为25℃的条件下,按1.2.2(1)中PEG 2000-K2HPO4双水相体系制备方法,考察在不同初始组成(10%~20%、15%~25%、20%~30%)下萃取 30 min安赛蜜回收率、分配系数及相比的变化,结果见图4(b)。随着初始组成中PEG 2000和K2HPO4浓度的增大,相比逐渐增大,PEG 2000-K2HPO4双水相体系对安赛蜜的萃取能力增大,但当初始浓度继续增大到20%~30%时,回收率和分配系数降低。可能是由于双水相体系中各组分质量分数增大,安赛蜜与双水相体系之间的作用力增强,容易向上相迁移,但随着组成含量的继续增大,高浓度的K2HPO4加剧了盐析作用,可能使上相更疏水,不利于安赛蜜的萃取;同时,下相K2HPO4可能会争夺安赛蜜,导致上相PEG 2000对安赛蜜的萃取能力降低。故本研究选用初始组成为15%~25%的PEG 2000-K2HPO4双水相体系萃取安赛蜜。

2.4.3 萃取温度对安赛蜜萃取的影响

选取15%~25%的PEG 2000-K2HPO4双水相体系,向双水相体系中加入安赛蜜标准溶液 2.0 mL,控制体系总质量为4 g,离心6 min,考察在萃取温度(25、35、45、55℃)下萃取30 min安赛蜜回收率、分配系数及相比的变化,结果见图4(c)。由图可知,温度越高,PEG 2000-K2HPO4双水相体系对安赛蜜的萃取能力越强,在25~55℃时,萃取温度提高有利于安赛蜜在上相回收,这可能是由于温度增高,PEG 2000的黏度减小,同时安赛蜜分子的运动更加自由,利于PEG 2000-K2HPO4双水相对安赛蜜的萃取。因此,本研究选择55℃为最佳萃取温度。
综上,得出PEG 2000-K2HPO4双水相体系萃取浓缩安赛蜜的最佳工艺为:初始组成为15%~25%的PEG 2000-K2HPO4双水相体系,经3 000 r/min离心6 min,55℃水浴萃取30 min。

2.5 方法验证

2.5.1 回收率

在最佳萃取条件下,取上相0.5 mL并适当稀释,相同条件下的空白双水相做参比,在228 nm波长处检测安赛蜜的吸光度并计算安赛蜜的回收率。进行5组平行实验,每组连续测定3次,取平均值,得到PEG 2000-K2HPO4双水相体系萃取安赛蜜的回收率及RSD如表2所示。
由表2可知,在最佳条件下PEG 2000-K2HPO4双水相体系萃取浓缩安赛蜜的平均回收率可达98.0%,RSD为1.7%,证明利用该方法萃取安赛蜜效果良好。

2.5.2 精密度

分别向PEG 2000-K2HPO4双水相体系中加入质量浓度低(10 μg/mL)、中(40 μg/mL)和高(100 μg/mL)的安赛蜜标准溶液,在最佳工艺下萃取浓缩,并在最大吸收波长处连续测定6次,计算RSD。所得低、中、高浓度回收率(RSD)分别为98.5%(2.2%)、96.7%(1.2%)和97.6%(0.5%)。证明该方法萃取安赛蜜精密度良好。

2.5.3 检出限和定量限

根据空白溶液在测定条件下的响应,以信噪比为3对应的溶液质量浓度作为该方法的检出限,以信噪比为10对应的溶液质量浓度作为该方法的定量限,计算得出该方法检出限和定量限分别为 0.33 μg/mL和1.1 μg/mL。

2.5.4 UV法准确性检验

为验证紫外-可见分光光度计检测结果的准确性,本研究采用安赛蜜质量浓度低(10 μg/mL)、高(100 μg/mL)组各3个样品,分别用HPLC和UV法进行检测和结果比对。其中,取PEG相100 μL适当稀释,经0.22 μm滤膜过滤后,用于HPLC对安赛蜜含量的检测,回收率和RSD见表3。
由表3可知,经HPLC方法验证,由UV法进行PEG 2000-K2HPO4双水相体系萃取安赛蜜含量的检测结果可靠。

2.6 样品测定

取居民饮用水水样1、2,经0.22 μm水系滤膜过滤后,在最佳条件下(即初始组成为15%~25%的PEG 2000-K2HPO4双水相体系,3 000 r/min离心 6 min,55℃水浴萃取30 min)未检测到安赛蜜。低浓度(10 μg/mL)加标后回收率分别为92.4%±1.4%和95.0%±1.7%,证明该方法萃取水样中安赛蜜效果良好。

3 结论

首先研究了不同分子量的PEG与K2HPO4的成相能力,建立了一种使用PEG 2000-K2HPO4双水相体系萃取人工合成甜味剂安赛蜜的方法。绘制了PEG 2000-K2HPO4双水相体系的相图及系线图,讨论了离心时间、萃取温度和初始组成3个因素对安赛蜜回收率的影响,获得萃取安赛蜜的最佳工艺条件。结果表明,采用15% PEG 2000和25% K2HPO4对安赛蜜进行萃取,离心6 min后55℃恒温萃取30 min,对自来水样的加标回收率可达92.4%~95.0%,RSD为1.4%~1.7%,结果令人满意。该方法可以有效萃取浓缩人工合成甜味剂安赛蜜,可为安赛蜜含量的检测提供参考,在未来的研究工作中,将进一步探索其在食品及环境中的检测应用。

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基金资助

国家自然科学基金项目(22407068)

黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目(145309611)

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