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棘孢木霉高产漆酶诱变菌株选育及发酵条件优化

朱利霞 ,  王桂端 ,  麻益歌 ,  谭伟 ,  马雯婧 ,  倪雯珂 ,  李鑫 ,  陈居田 ,  李俐俐

现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (12) : 134 -139.

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现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (12) : 134-139. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.12.023
科研与开发

棘孢木霉高产漆酶诱变菌株选育及发酵条件优化

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Optimization of breeding and fermentation conditions for highly laccase-producing Trichoderma asperellum mutagenesis strains

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摘要

以棘孢木霉为出发菌株,利用微波和盐酸羟胺诱变,采用愈创木酚法筛选高产漆酶突变株。采用单因素试验和正交试验确定最佳发酵条件,借助模拟培养试验验证诱变菌株的漆酶活力。结果表明,微波诱变15 s,盐酸羟胺0.9 g/L时致死率为90%,此条件下得到一株高产菌株MP1-1,其漆酶活力提高70.8%。菌株最佳发酵条件为:葡萄糖为碳源(1%)、硝酸铵为氮源(1%)、pH 6.0、Cu2+浓度0.09 mmol/L、接种量1 mL、培养温度28℃,此时菌株MP1-1漆酶活力达54.51 U/L。以MP1-1处理聚乙烯14 d,失重率达0.77%,聚乙烯表面有明显凹痕与坑洞,并且引入了活性官能团羰基与醚键。微波-盐酸羟胺复合诱变结合发酵条件的优化能提高棘孢木霉产漆酶的能力,为棘孢木霉的工业化应用奠定了良好的基础。

Abstract

Trichoderma asperellum is taken as a start strain to be mutagenized by microwave and hydroxylamine hydrochloride,and highly laccase-producing mutagenesis strains are screened out through guaiacol method.The optimum fermentation conditions are determined via single factor tests and orthogonal tests,and the laccase activity of the mutagenesis strains is verified by simulated culture test.Results show that a high-yield strain,MP1-1,is obtained under the conditions that microwave mutagenesis has performed for 15 s,the concentration of hydroxylamine hydrochloride is 0.9 g/L,and the lethal rate is 90%.The laccase activity of MP1-1 increases by 70.8%.The optimum fermentation conditions for the strains are as follows:glucose is used as carbon source with a dosage of 1%,ammonium nitrate is used as nitrogen source with a dosage of 1%,pH=6.0,Cu2+ concentration is 0.09 mmol/L,inoculation amount is 1 mL,and culture temperature is 28℃.Under these conditions,the laccase activity of MP1-1 reaches 54.51 U/L.The weight loss rate of polyethylene,which has been treated by MP1-1 for 14 days,is 0.77%.There are obvious pits and holes on the surface of polyethylene,and the active functional groups such as carbonyl and ether bonds are introduced there.Optimizing the microwave-hydroxylamine compound mutagenesis combined with fermentation conditions can enhance the laccase-producing capacity of Trichoderma asperellum,which lays a good foundation for the industrial application of Trichoderma asperellum.

Graphical abstract

关键词

棘孢木霉 / 发酵条件优化 / 诱变 / 漆酶

Key words

Trichoderma asperellum / optimization of fermentation conditions / mutagenesis / laccase

Author summay

朱利霞(1990-),女,博士,副教授,研究方向为微生物应用, 。

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朱利霞,王桂端,麻益歌,谭伟,马雯婧,倪雯珂,李鑫,陈居田,李俐俐. 棘孢木霉高产漆酶诱变菌株选育及发酵条件优化[J]. 现代化工, 2025, 45(12): 134-139 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.12.023

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聚乙烯价格低廉、热力学性能优越、稳定性好,被广泛应用于各行各业中,这也使其因不易降解而对环境造成极大的威胁[1]。部分真菌能够将聚乙烯作为碳源,进而将聚乙烯彻底降解为二氧化碳和水,漆酶则是聚乙烯降解过程的关键酶。漆酶是一类含铜氧化酶,可以催化氧化酚类、羟基吲哚类的酚羟基化合物形成苯氧基自由基,再通过氧化偶联、化学结构重排、键的断裂与生成等形成最终的聚合产物[2]。漆酶还可以催化氧分子产生唯一副产物—水,是一种天然环保的绿色催化剂[3]。真菌漆酶通常为胞外酶,有较好的热稳定性、金属耐受性和底物催化性,被广泛应用于食品、制浆造纸、纺织工业及环保等领域[4]。然而,菌株产漆酶能力普遍偏低,紫外、微波等物理方法或亚硝基胍等化学物质诱变手段常被用于选育高产漆酶菌株。易小畅等[5]以红芝菌株为出发菌株,经过紫外-亚硝基胍诱变后菌株的漆酶活性较出发菌株提高187%且产酶稳定。杨创明等[3]对紫芝菌株Gs-1液体产酶培养基进行优化,优化后菌株漆酶活力为优化前的26.46倍。
鉴于此,为获得高产漆酶菌株,本研究以实验室保藏的产漆酶菌株棘孢木霉MP1为出发菌株,通过微波-盐酸羟胺诱变,筛选出一株漆酶活力较高的菌株,利用单因素实验和正交实验进行突变株发酵条件的优化,并利用高产漆酶菌株开展模拟发酵池降解聚乙烯试验,以期为漆酶的应用提供基础数据。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

菌株:实验室保藏的产漆酶菌株棘孢木霉MP1。
葡萄糖、愈创木酚、琼脂粉、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、硝酸铵、氯化钠、七水合硫酸亚铁、七水合硫酸锌、一水合硫酸锰、硫酸铜均为分析纯。
HWS250型恒温恒湿培养箱;LDZX50KBS型高压灭菌锅;SWCJ2FD型洁净工作台;H1850型台式冷冻高速离心机;Tescan Mira 3型原位拉伸扫描电子显微镜;Nicolet iS50型光谱仪;UV-2600型紫外-可见分光光度计。

1.2 培养基制备

马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)。马铃薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然,121℃灭菌20 min。
马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)。马铃薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然,分装锥形瓶后121℃灭菌20 min。
无机盐液体培养基。K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.7 g、MgSO4·7H2O 0.7 g、NH4NO3 1 g、NaCl 0.005 g、FeSO4·7H2O 0.002 g、ZnSO4·7H2O 0.002 g、MnSO4·H2O 0.001 g、蒸馏水1 000 mL,121℃灭菌20 min。
愈创木酚—马铃薯葡萄糖固体培养基。马铃薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、愈创木酚0.4 mL、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然,121℃灭菌20 min。
漆酶选择发酵培养基。葡萄糖10 g、NH4NO3 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO4 2 g、MnSO4·H2O 0.04 g、CuSO4 0.016 g、蒸馏水1 000 mL,分装锥形瓶后121℃灭菌20 min。

1.3 培养方法

1.3.1 菌株活化

制备萌动孢子。将棘孢木霉MP1接种于PDA上,于28℃培养箱中培养3 d后,以蒸馏水冲洗培养基表面使孢子从培养基表面脱落,获得孢子悬液。调节孢子浓度为106个/mL。按1∶20的比例将孢子悬液2.5 mL接入50 mL的限量培养液,30℃、150 r/min培养数小时,使孢子萌动而尚未生长。
每隔2 h吸取孢子悬液10 μL于载玻片上观察孢子的萌动情况(每个视野内10~20个孢子),计算萌动孢子数与原孢子数的比值,计算孢子萌动率并记录萌动时间。萌动率在20%~30%较好。

1.3.2 诱变处理

微波诱变。将上述孢子悬液以1∶50(体积比)接种于PDB中,置于微波炉(700 W,2 450 MHz)中分别辐照处理0(对照)、5、10、15、20 s。处理后于28℃、150 r/min下培养48 h。观察孢子萌发情况,根据致死率确定最佳微波诱变时间。
盐酸羟胺诱变。取1 mL上述孢子悬液分别接入盐酸羟胺浓度为0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L的PDB中,在28℃、150 r/min条件下培养48 h。以盐酸羟胺浓度为0 g/L的孢子萌发情况为对照,计算致死率确定最佳诱变浓度。
复合诱变。取1 mL经微波辐照过的孢子悬液,接种到不同盐酸羟胺浓度的PDB中,28℃、150 r/min条件下培养48 h,以未进行诱变处理的孢子悬液为对照,计算致死率。
诱 变 致 死 率 ( % ) = [ ( 未 经 处 理 孢 子 萌 发 数 - 处 理 后 孢 子 萌 发 数 ) / 未 经 处 理 孢 子 萌 发 数 ] × 100 %

1.3.3 优势菌株的筛选

将诱变菌株接种至PDB中,在28℃、150 r/min条件下培养5 d,测定菌株漆酶活力。将筛选得到的优势菌株连续传代培养5次,每代分别接种至产酶培养基中,培养5 d后测定漆酶活力。

1.4 发酵条件优化

1.4.1 单因素实验

采用单因素法依次探究1%(质量比)碳源(乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖)、1%(质量比)氮源(硝酸铵、硫酸铵、蛋白胨、酵母膏和牛肉膏)、Cu2+浓度(0、0.03、0.06、0.09、0.10、0.12 mmol/L)、pH(4.5、5.0、5.5、6.0、7.0)、温度(20℃、25℃、28℃、35℃、40℃)、接种量(0.5、1、2、2.5、3 mL/50 mL)对突变菌株漆酶活力的影响。

1.4.2 正交实验

在单因素实验的基础上,确定合适的碳源和氮源,并选取对产漆酶有影响的其余4个关键因子即Cu2+浓度、接种量、初始pH值、培养温度为自变量,进行L9(34)实验设计。根据因素设计表配制发酵培养基,将活化的菌种接种于发酵培养基中培养5 d后测定漆酶活力,优化菌株产漆酶条件。

1.5 模拟发酵池验证试验

采用模拟发酵池探究扩繁工艺优化前与扩繁工艺优化后诱变菌株对聚乙烯的降解效能,同时设置接种出发菌株的对照组和不接种菌株的空白处理组,每个重复处理3次。根据聚乙烯塑料的失重率、微观形态变化和官能团变化判断菌株的产漆酶能力。

1.6 漆酶活力测定

采用愈创木酚法测定漆酶活力[7]。将1 mL漆酶粗酶液与3 mL醋酸-醋酸钠缓冲液、1 moL愈创木酚混合后在25℃下孵育30 min,测定反应体系在波长465 nm处的吸光度。酶活力定义为每分钟内水解1 mmol愈创木酚的量定义为一个酶活力单位(U)。

2 结果与讨论

2.1 产漆酶菌株的筛选

根据漆酶与愈创木酚反应产生棕红色物质这一原理,结合变色圈直径和漆酶活力大小确定产漆酶能力较高的菌株。固体发酵体系中菌株的变色圈直径达到(4.5±0.1) cm,液体发酵体系中漆酶活力为5.83 U/L。因此,可以以MP1为出发菌株,进行后续诱变处理。

2.2 菌株诱变及遗传稳定性分析

2.2.1 菌株诱变

一般而言,致死率在85%~90%之间时正突变率较高[8]。微波诱变时间和盐酸羟胺浓度对菌株MP1致死率的影响见图1。由图1(a)可知,随微波处理时间的延长,菌株致死率增加。微波诱变5 s时致死率为60.0%,10 s时致死率为73.3%,15 s时致死率为86.7%,20 s时致死率为93.3%。如图1(b)所示,随着盐酸羟胺浓度的升高,菌株MP1的孢子萌发量逐渐减少。当盐酸羟胺浓度为0.9 g/L时,致死率达到85%。因此,选择微波诱变15 s、0.9 g/L的盐酸羟胺为菌株MP1的最佳诱变条件。
以微波突变株为出发菌株,将微波辐照处理后得到的最优性状突变株制成菌悬液,准备盐酸羟胺诱变,观察菌丝生长量并计算致死率,经计算致死率为90%,复合诱变比单一诱变的效果好。经过复合诱变筛选共得到20株高产漆酶的菌株,根据菌落周围变色圈的大小挑选出10株菌发酵培养,其中4株菌的漆酶活力高于初始菌株(5.83 U/L),这4株诱变菌株中又以MP1-1菌株的漆酶活力最高。
以MP1为对照,对MP1-1进行摇瓶发酵培养,测得发酵液漆酶活力,如图2所示。第5 d时菌株MP1-1漆酶活力最大(8.54 U/L),比出发菌株MP1提高70.8%,证实了MP1-1为优势菌株。然而超过5 d后菌株漆酶活力降低,这可能是由于随培养时间的延长,菌丝出现老化且培养基中营养成分逐渐耗尽[6-7]。李阳等[9]发现云芝Tv-1漆酶活性在第8天时最高,为235.20 U/L,高于本研究菌株漆酶活性,且与本研究培养时间不同,可能是由于不同菌株之间的差异导致的。

2.2.2 优势菌株MP1-1的遗传稳定性

菌株遗传稳定性是工业化应用的前提,连续传代培养可能会导致高产突变菌株性能降低[10]。为评估优势突变株的遗传稳定性,将菌株MP1-1连续培养5代后,每代进行摇瓶发酵5 d后测定漆酶活力。由图3可知,菌株MP1-1漆酶活力介于8.54~8.96 U/L,产酶特性稳定,因此,复合诱变产生的菌株MP1-1遗传稳定性好。

2.3 单因素试验

对于异养微生物木霉菌而言,碳源即能源,对其生长代谢有重要作用。不同碳源培养条件下,菌株漆酶活力有明显差异,如图4所示。以乳糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉为碳源时菌株均可产漆酶,其中葡萄糖为碳源时菌株产酶水平最高,漆酶活力可达8.33 U/L,葡萄糖为单糖,更利于菌株利用,因此葡萄糖作为碳源最利于漆酶合成。王慧冬等[11]发现蔗糖对于枯草芽孢杆菌的促生作用最为明显,然而毛栓孔菌以可溶性淀粉为碳源时对漆酶活力的促进最为显著[12],这可能是由于不同菌株的最适碳源不同。
以酵母膏和蛋白胨为氮源时,培养基颜色明显变深,测定漆酶活力发现,以酵母膏为唯一氮源时菌株产酶水平最高,漆酶活力可达184.03 U/L;以蛋白胨为氮源时,测得的菌株漆酶活力为81.94 U/L,这与二者作为氮源时培养基颜色明显变深的现象一致,这种高酶活力可能是由于培养基本身的颜色对愈创木酚显色的掩盖,不能真实地反映这两种培养基中漆酶活力水平。以硝酸铵为氮源时,菌株漆酶活力为22.22 U/L。因此,该菌株可以硝酸铵为最佳产漆酶的氮源。徐春燕等[13]发现以硝酸铵为氮源时,端梗霉Z45漆酶活力最高,这与本研究结果一致,表明该菌株更倾向于利用无机氮源。这可能是由于无机氮源更利于菌株生长利用,而牛肉膏提供的氮源属于有机氮源,不能快速被微生物转化利用。
漆酶属于多铜蛋白家族,其活力和产量受Cu2+影响[14]。铜离子浓度为0 mmol/L培养时菌株产酶水平最低,印证了铜离子对漆酶的诱导作用[1];Cu2+浓度为0.1 mmol/L时菌株漆酶活力为6.94 U/L。Cu2+为0.06 mmol/L时菌株酶活力最高(9.72 U/L),该浓度最利于漆酶合成。由此,过量的Cu2+可能对木霉菌的生长和漆酶的合成产生抑制作用[15]。
微生物的生长、繁殖需要合适的酸碱度,pH对菌株生长代谢和产酶量有重要作用[16]。由于发酵过程中培养基pH会随时间的延长而改变,因此,本实验研究的是菌体发酵时初始pH对菌株产酶量的影响。菌株pH升高至7.0时,培养基颜色出现质的变化由无颜色跃变为黄褐色,这时葡萄糖可能发生了氧化反应,也可能是构象上发生了变化[17]。黄褐色的出现会直接影响酶活性的测定,导致漆酶活力的高估。此外,pH为7.0时,菌株生长状况不佳,这可能与葡萄糖发生变化活性降低,菌株难以吸收利用有关[17]。因此,在后续测定菌株漆酶活性时,舍弃pH为7.0时酶活性的测定。当pH为5.5时菌株产酶水平最高,其漆酶活力可达26.39 U/L,发酵培养基初始pH为5.5时最利于漆酶合成。
适宜的温度能够促进菌株生长和产酶,该菌株漆酶活力随温度的增加先增加后降低,以培养温度为28℃时其产酶水平最高,酶活力可达19.44 U/L;培养温度为40℃时产酶水平最低。可知,培养温度为28℃时最利于漆酶合成。这与Othman等[18]的研究结果一致,高温会抑制木质素降解酶的产生,其主要是由于高温会破坏细胞膜的结构,改变蛋白质的代谢过程[19]。
接种量的多少也直接影响菌株漆酶活力[20]。随接种量的增加,菌株漆酶活力先增加后降低。接种量过少时菌体浓度过低,发酵产酶周期延长,进而单位时间内酶的产量减少;接种量过大时,菌株的大量繁殖导致培养基消耗过快,正常的代谢受到阻碍,从而也使得酶的产量减少。当接种量为2.0 mL时菌株产酶水平最高,其漆酶活力可达11.11 U/L,因此,接种量为2.0 mL时最利于漆酶合成。

2.4 发酵条件验证

2.4.1 正交试验结果分析

各因素间的交互作用对棘孢木霉诱变菌株MP1-1的影响见表1,按照极差R值确定各因素对菌株漆酶活力的影响大小顺序为C(温度)>A(Cu2+浓度)>B(pH)>D(接种量),菌株MP1-1产漆酶的最优组合为A3B3C2D1,各因素最佳值分别为Cu2+浓度0.09 mmol/L、pH 6.0、温度28℃、接种量1 mL。优化条件下菌株MP1-1漆酶活力显著高于其他条件,漆酶活性为54.51 U/L。陈守菊等[21]发现棘孢木霉漆酶活力最高达到571.32 U/L,远高于本研究结果,这可能是不同地区同一菌株间出现了变异。相比之下,本研究中的菌株产漆酶能力还有待提高,可以考虑通过定点饱和突变的方法提高酶的活性;或者通过基因改造,在不影响漆酶作用机制的前提下,提高菌株产酶稳定性。

2.4.2 回归模型方差分析

回归模型方差分析结果如表2所示,模型F值为4 029.714、P<0.001,说明该模型设置合理,可以预测Cu2+浓度、温度、pH和接种量对漆酶活力的影响。模型决定系数R2=0.999(调整后R2=0.999),说明模型预测值与试验值相关性较好。通过比较Cu2+浓度、温度、pH和接种量的F值可知,各因素对漆酶活力的影响有显著性差异,并且4个因素对漆酶活力的影响主次顺序为C(温度)>A(Cu2+浓度)>B(pH)>D(接种量),此结果与正交试验计算结果一致。

2.5 模拟发酵池验证试验

2.5.1 聚乙烯失重率

由于漆酶是一种聚乙烯降解过程中的关键酶,采用聚乙烯失重率评估各处理中菌株漆酶活力。在培养14 d时取样清洗并烘干后测定聚乙烯的失重率,结果如表3。测得扩繁工艺优化后诱变菌株MP1-1处理的聚乙烯膜片失重率高达0.77%,是未接种菌株处理的10.8倍,是出发菌株MP1处理的2.89倍,是扩繁工艺优化前诱变菌株MP1-1处理的1.98倍。这也说明了菌株MP1-1具有较高的漆酶活力。

2.5.2 聚乙烯表面微观特征变化

如图5所示,未接种菌株处理的聚乙烯膜片表面光滑平整,而出发菌株处理与扩繁工艺优化后的诱变菌株MP1-1处理的聚乙烯膜片表面都有明显凹痕与坑洞,且扩繁工艺优化后的诱变菌株MP1-1处理的聚乙烯表面比出发菌株MP1处理的膜片表面更为粗糙。该结果印证了菌株MP1-1漆酶活力高于其他菌株。
如图6所示,与未接种菌株处理的聚乙烯方片相比,出发菌株MP1处理的聚乙烯方片在1 020~1 275 cm-1范围出现的吸收峰对应醚键C—O—C,1 550~1 610 cm-1处羧基振动有明显吸收,~1 716 cm-1处羰基振动也有明显吸收,诱变菌株MP1-1处理后聚乙烯方片的吸收峰则在出发菌株MP1处理后聚乙烯方片吸收峰的基础上发生偏移。这表明在菌株作用下,聚乙烯引入了新的极性官能团羰基(—C=O)与醚键(C—O—C)。

3 结论

以棘孢木霉MP1为出发菌株,采用微波-盐酸羟胺诱变,筛选得到遗传稳定性好的突变株MP1-1,其漆酶活性较出发菌株提高70.8%。
通过单因素和正交设计试验,确定菌株MP1-1的最佳发酵条件为葡萄糖1%、硝酸铵1%、Cu2+浓度0.09 mmol/L、pH 6.0、温度28℃、接种量1 mL(2%)。在此条件下,菌株漆酶活力达到54.51 U/L。
该菌株能够以聚乙烯为唯一碳源进行生长,14 d后可使聚乙烯失重率为0.77%,膜片表面有明显坑洞和裂痕,并向聚乙烯中引入活性官能团羰基(—C=O)与醚键(C—O—C),证实诱变菌株MP1-1能够产漆酶并可用于聚乙烯的降解。

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基金资助

河南省科技研发计划联合基金(245101610081)

河南省科技研发计划联合基金(225101610054)

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省部共建小麦玉米国家重点实验室开放基金(SKL2023KF08)

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