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基于双香豆素开-闭环转化的高选择性比率型肼荧光探针研究

曾碧涛 ,  何爱江 ,  万志翔 ,  赵志刚 ,  石治川

现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (10) : 276 -281.

PDF (2131KB)
现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (10) : 276-281. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.10.044
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基于双香豆素开-闭环转化的高选择性比率型肼荧光探针研究

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Highly selective and sensitive detection of hydrazine via dicoumarin ring-opening/closing ratiometric fluorescent probe

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摘要

基于双香豆素查尔酮骨架设计并开发了一种新型比率型荧光探针(DCO),可实现对肼(N2H4)的高选择性检测。DCO与N2H4反应后,紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱均呈现显著特征峰衰减/新峰形成的双通道动态响应。该探针对N2H4表现出优异的选择性,检测限低至10-6 mol/L,并在较宽pH范围内保持稳定。核磁共振氢谱表征证实,探针对N2H4的识别机制涉及α,β-不饱和羰基查尔酮环化反应,进而触发基于分子内电荷转移(ICT)过程导致比率型荧光信号变化。实际应用表明,荧光探针DCO能应用于真实水样中N2H4的定量测定。

Abstract

Based on a coumarin-chalcone skeleton,a novel ratiometric fluorescent probe,DCO,is designed and developed for highly selective detection of hydrazine (N2H4).Upon reaction with N2H4,DCO exhibits a dual-channel dynamic response characterized by the significant attenuation of characteristic peaks in UV-Vis absorption spectra and the formation of new emission peaks in fluorescence spectra.This probe demonstrates excellent selectivity toward N2H4,with a detection limit as low as 10-6 mol/L,and remains stable over a wide pH range.It is confirmed through 1HNMR characterization that the recognition mechanism of hydrazine by this probe involves a cyclization reaction of α,β-unsaturated carbonyl chalcone moiety with N2H4,subsequently triggering ratiometric fluorescence signal changes through an intramolecular charge transfer (ICT) process.Practical applications verify that DCO can be effectively applied to the quantitative detection of N2H4 in real water samples.

Graphical abstract

关键词

肼 / 分子内电荷转移 / 查尔酮环化 / 双香豆素 / 比率型探针

Key words

hydrazine / intramolecular charge transfer / chalcone cyclization / dicoumarin / ratiometric probe

Author summay

曾碧涛(1982-),男,硕士,副教授,研究方向为有机合成,.

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曾碧涛,何爱江,万志翔,赵志刚,石治川. 基于双香豆素开-闭环转化的高选择性比率型肼荧光探针研究[J]. 现代化工, 2025, 45(10): 276-281 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.10.044

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肼(N2H4)是一种具有氨样气味的挥发性无机二胺化合物[1],因强碱性、显著的亲核性与高还原性,在工业领域有着广泛的应用[2]。肼既可作为高能燃料推进剂,被广泛用于导弹、卫星和火箭推进系统普遍采用[3-4],同时在医药、农药、催化剂、纺织染料等的合成中也扮演着重要角色[5]。然而,肼的毒性不容忽视,它对生物体的发育和细胞生化过程具有显著的负面影响[6]。长期或过量暴露可刺激皮肤,导致肝脏、肾脏及中枢神经系统损伤[7-9]。在环境方面,肼的大规模工业化生产、运输和含肼废水处理过程也带来了潜在的环境风险,这些污染物可能对生态系统构成严重威胁。鉴于此,美国环境保护署(EPA)将肼列为潜在致癌物,规定饮用水中肼的最大允许浓度为10×10-9 mol/L[10]。因此,开发新型的高灵敏度肼检测探针对于保障公共安全和环境保护具有重要意义。
目前,肼的定性和定量分析主要依赖于一系列传统检测技术,包括高效液相色谱法[11]、比色法[12]、分光光度法[13]、滴定法[14]、电化学法[15]及荧光分析法[16-17]等。在这些方法中,荧光分析法因操作简便、响应时间短、选择性好和灵敏度高等显著特点,已经在生物医学诊断和环境痕量污染物的筛查领域占据了重要的地位[18-19]。这种方法的优势使得荧光分析法成为了一个不可或缺的分析工具,特别是在需要快速、准确地检测低浓度肼的情况下。
鉴于香豆素衍生物具有大斯托克斯位移、良好的溶解性以及高量子产率,使其成为理想的荧光团,并在生物传感、环境监测和分子探针设计等多个领域得到广泛应用[20-21]。本研究采用7-二乙氨基香豆素作为起始材料,通过两步反应合成了一种新型基于双香豆素查尔酮骨架的比率型荧光探针(DCO),用于特异性检测肼的检测。当DCO与N2H4发生反应时,其紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱均出现了显著变化,具体表现为特征吸收/发射峰的减少和新峰的形成,这种变化呈现出双通道的动态响应模式。DCO对N2H4表现出高选择性(共存干扰物质无显著干扰)、低检测限(LOD=5.18 μmol/L)及宽pH(5~9)适应性。通过核磁共振氢谱(1HNMR)的分析结果,确认了DCO对肼的识别机制涉及肼诱导的α,β-不饱和羰基查尔酮环化反应。这一反应引发了基于分子内电荷转移(ICT)机制的比率型荧光响应。核磁共振氢谱(1HNMR)表征证实,DCO对N2H4的识别机制为N2H4诱导的α,β-不饱和羰基查尔酮环化反应,触发基于分子内电荷转移(ICT)的比率型荧光响应。这一新型探针的开发为环境和水生生物体系中痕量肼的检测提供了一种高效、可靠的分析手段,具有重要的应用价值。

1 实验部分

1.1 实验仪器

AVANCE NEO 600 MHz核磁共振波谱仪(Me4Si作内标),德国布鲁克公司生产;FINNIGAN-LCQ DECA型质谱仪,美国赛默飞公司生产;UV-6100型双光束紫外-可见光分光光度计,上海美普达公司生产;Dual-FL型荧光光谱仪,日本HORIBA公司生产;IR200型傅里叶变换红外光谱仪(KBr压片),美国赛默飞公司生产;WRS-1B型数字熔点仪,温度计未经校正,上海精密仪器仪表有限公司生产;WP-UPT-10型超纯水机,四川沃特尔水处理设备有限公司生产;PE28型pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司生产。

1.2 实验试剂

7-二乙氨基香豆素、2-乙酰氨基吡啶、三氯氧磷、吡咯烷、N,N-二甲基甲酰胺、氯仿、二氯甲烷、甲醇、石油醚、水合肼、羟胺、三乙胺、苯胺、尿素、半胱氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、硫化钠、硫氢化钠、亚硫酸钠、四丁基氰化铵,所有试剂均为市售分析纯级。实验用水为去离子水。

2 试验方法

2.1 探针DCO的合成

探针DCO的合成路线如图1所示。7-二乙氨基香豆素-3-醛(中间体2)根据已报道文献[22]制备所得。
探针DCO的合成:向圆底烧瓶中依次加入7-二乙氨基香豆素-3-醛(736 mg,3 mmol)和2-乙酰氨基吡啶(163 mg,1 mmol),将这些原料溶解在二氯甲烷/甲醇混合溶剂中(体积比1∶1,6 mL),然后吡咯烷(2滴)作为催化剂。在氮气(N2)氛围下,将反应混合物在室温下搅拌24 h。反应完成后,通过减压蒸馏的方法除去溶剂。所得粗产品经柱纯化(洗脱剂:二氯甲烷/石油醚=1∶1,v/v),得到红色固体探针DCO(318 mg,收率为51.5%)。m.p.267.2~268.8℃。IR(KBr),ν,cm-1:3 458、2 986、2 377、1 721、1 629、1 570、1 518、1 418、1 338、1 289、1 200、1 136、1 000、830。1HNMR(600 MHz,CDCl3),δ:8.98(d,J=15.9 Hz,2H)、8.30(d,J=7.5 Hz,2H)、8.25(s,2H)、7.99(t,J=7.5 Hz,1H)、7.90(d,J=15.9 Hz,2H)、7.65(d,J=8.7 Hz,2H)、6.54(d,J=8.7 Hz,2H)、6.38(s,2H)、3.42(q,J=7.3 Hz,8H)、1.23(t,J=7.3 Hz,12H)。13CNMR(151 MHz,CDCl3),δ:188.53、160.85、156.95、153.12、151.82、144.18、139.30、138.10、130.91、125.27、120.95、115.50、109.52、109.30、96.92、91.92、45.01、29.68、12.60、12.51。ESI-MS,m/z:618.57[M+1]+。

2.2 溶液的配制

水合肼、胺、氨基酸及阴离子溶液分别采用相应的市售试剂和钠盐或铵盐,配制成浓度为1×10-2 mol/L的去离子水溶液。探针DCO用氯仿溶解,定容得浓度为1×10-3 mol/L的储备液。光谱测试条件如下:激发波长320 nm,狭缝宽2 nm,荧光发射光谱扫描范围250~830 nm。

3 结果与讨论

3.1 探针DCO识别肼的光学响应

在探究探针DCO对N2H4的光学响应特性方面,本研究采用紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱(激发波长λex=320 nm)对DCO的动态响应过程进行了详细表征(图2、图3)。在室温条件下,将N2H4(1 mmol/L)加入到探针DCO(10 μmol/L)的DMF/H2O(体积比9∶1)溶液体系后,每隔3 min实时监测并记录光谱数据,持续观察30 min。紫外-可见吸收光谱显示,476 nm处的特征吸收峰随反应时间的推移呈梯度衰减直至完全消失。与此同时,在378 nm处新生吸收带随着反应的进行而持续增强,并伴随着溶液颜色从黄色逐渐转变为无色。这一变化趋势与荧光光谱的结果相一致,其中DCO在593 nm处基于分子内电荷转移(ICT)的黄色荧光发射被完全抑制,而453 nm处蓝色荧光发射则显著增强。值得注意的是,紫外-可见吸收光谱中312 nm与410 nm处呈现明确的等吸收点,荧光光谱中 546 nm处出现等发射点。这些等吸收/发射点的出现进一步证实了反应体系中存在2种组分的动态平衡,从而支持了新荧光物质生成的结论。这些发现为深入理解探针DCO与N2H4之间相互作用的光学响应机制提供了重要的实验依据。

3.2 探针DCO对肼识别的选择性和抗干扰能力

为评估探针DCO对N2H4的选择性识别能力,考察了DCO与生物体系常见物质(包括胺类、氨基酸及阴离子)的荧光响应特性。在DCO(10 μmol/L)的DMF/H2O(体积比9∶1)溶液体系中,分别加入N2H4(1 mmol/L)或等浓度的干扰物质(胺类:羟胺、三乙胺、苯胺、尿素;氨基酸:半胱氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸;阴离子:S2-、HS-、S ${\mathrm{O}}_{3}^{2-}$、CN-),室温反应30 min后测定其荧光发射光谱(λex=320 nm)。如图4所示,当仅加入N2H4时,DCO在593 nm处的荧光强度显著猝灭,同时伴随着453 nm处出现新的荧光发射峰。其他干扰物质加入后,DCO的荧光信号没有显著变化,这证实了DCO对N2H4具有高度的选择性。
竞争性实验(表1)进一步表明,当上述干扰物质(1 mmol/L)与N2H4(1 mmol/L)共存时,探针DCO(10 μmol/L)仍能维持对N2H4的特异性荧光响应,即593/453 nm双通道变化趋势与单独加入N2H4时一致,且荧光强度变化幅度未受明显干扰。这一结果进一步证实了DCO在复杂生物基质中对N2H4检测的抗干扰性能显著,表明该探针在生物分析中的应用潜力。

3.3 浓度梯度实验及检测限

为评估探针DCO对N2H4的检测灵敏度,通过浓度梯度实验(从0~120摩尔当量)来考察探针的识别性能,结果如图5所示。当N2H4处于低浓度区间(0~60摩尔当量)时,DCO(10 μmol/L)在 593 nm处的荧光发射强度呈现浓度依赖性增强,同时453 nm处新生发射带显著形成,推测该现象源于N2H4对探针分子中α,β-不饱和羰基的特异性亲核加成,导致分子共轭体系重构及ICT效应增强。当N2H4浓度进一步增加到70~110当量时,593 nm发射带逐步消减而453 nm处荧光强度持续上升。当N2H4浓度达到110当量时,双通道荧光强度比(I453 nm/I593 nm)趋于稳定,这表明探针与N2H4之间的环化反应已经达到平衡。
定量分析结果如图6所示,在15~110当量的N2H4浓度范围内,DCO于453 nm处的荧光强度与N2H4浓度呈良好线性关系(R2=0.996 75)。依据IUPAC推荐方法,采用LOD=3σ/k公式计算得检测限(LOD)为5.18 μmol/L(σ为空白溶液3次测量的标准偏差;k为标准曲线斜率),这个LOD值表明DCO对N2H4具有低至10-6 mol/L级的检出能力,证实了该探针在检测N2H4方面的优异灵敏度。

3.4 pH对探针DCO识别肼的影响

为评估探针DCO的生物环境适用性,考察了其在不同pH条件下的稳定性(图7)。实验结果表明,探针DCO(10 μmol/L)在宽pH范围内(2~10)具有稳定的荧光性质。这一稳定性对于探针在生物体系中的应用至关重要,因为生物体内的pH通常在这个范围内波动。进一步的研究发现,当在含有N2H4(1 mmol/L)体系中DCO的荧光发射行为,DCO与N2H4反应生成的环化产物(DCO-Hy)在生理相关的pH范围(5~9)内也能保持稳定。这一特性意味着探针DCO及其反应产物在生理条件下具有良好的稳定性,使其能够在没有缓冲剂的条件下直接适应生理环境。这种在生理pH范围内保持稳定的能力对于探针在复杂生物体系中的实际应用具有重要意义。它确保了探针在生物样本中的有效性和可靠性,尤其是在那些不包含外部缓冲系统的生物化学实验中。因此,探针DCO的这种生物环境适用性为其在生物分析、细胞成像和生物医学研究等领域的应用提供了坚实的基础。

3.5 探针DCO识别肼的机理探究

基于上述实验结果,可推断探针DCO与N2H4相互作用时,N2H4诱导探针分子中α,β-不饱和羰基发生查尔酮环化反应(图8)。这一反应通过阻断分子内电荷转移(ICT)导致荧光性质的显著变化,从而触发比率型荧光响应。为确证环化反应机制,通过柱层析分离获得反应产物DCO-Hy,并采用 1HNMR(600 MHz,CDCl3)进行结构表征。对比DCO与DCO-Hy的核磁氢谱(图9)发现,原探针结构中α,β-不饱和羰基对应的烯基氢信号(δ 6.38和8.25×10-6)完全消失,同时在δ 3.16×10-6、3.68×10-6、5.04×10-6处出现3组新特征峰,分别归属为吡唑啉环的次甲基和亚甲基,这些NMR数据与理论预测的环化产物结构特征完全吻合,提供了直接的证据来确证所观察到的吡唑啉环化反应机理。该证据与理论预测的环化产物结构完全吻合。

3.6 水样中N2H4检测

为评估探针DCO的实用价值,选取了市售饮用纯净水、白酒(五粮醇)这2种液体样来进行测试。所有水样品均通过0.2 mm滤膜过滤,以去除较大的特定杂质,然后通过萃取工艺去除残留的有机物。将所得样品在10.0 mL容量瓶中用DMF/H2O(体积比9∶1)稀释。各水样中分别都加标200、400、800 μmol/L的N2H4。结果如表2所示,探针DCO具有良好的回收率,在N2H4的分析中表现出较高的准确性。纯净水回收率在98.63%~107.0%,白酒回收率在97.0%~104.25%;纯净水、白酒的相对标准偏差(RSD)分别为≤3.64%和≤3.23%。因此,探针DCO可以测量真实液体中N2H4的浓度,在环境和食品分析中具有实用价值。

4 结论

基于双香豆素查尔酮骨架设计并合成了比率型荧光探针DCO。该探针在DMF/H2O(体积比9∶1)体系中与N2H4反应时,紫外-可见吸收光谱显示476 nm峰衰减、378 nm处出现新的吸收峰,溶液由黄色褪为无色;同步荧光光谱中593 nm发射峰被抑制,453 nm发射峰显著增强,且紫外(312/410 nm)与荧光(546 nm)等特征点证实新荧光物质的动态生成。探针对N2H4具有高选择性,即使在干扰物存在下也无影响,并且具有低至10-6 mol/L的灵敏度,检测限为5.18 μmol/L。荧光强度比(I453 nm/I593 nm)随N2H4浓度(15~110当量)线性变化。探针在pH 2~10范围内稳定,其环化产物DCO-Hy在生理pH(5~9)条件下也能保持稳定的荧光信号。核磁氢谱表征证实识别机制为N2H4诱导α,β-不饱和羰基发生查尔酮环化反应,生成含吡唑啉环的蓝色荧光物DCO-Hy。该探针具备比率型响应特性、抗干扰能力强以及宽pH适应性,为环境与生物体系中肼的痕量检测提供了一种可靠的分析方法。这一研究成果有望为相关领域的痕量分析提供新的思路和工具。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用
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