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透明质酸疏水自组装纳米粒制备及其负载淫羊藿苷抗神经炎症研究

杨月蕙 ,  杨晨 ,  杨思敏 ,  彭效明 ,  管洁 ,  居瑞军

现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (10) : 118 -123.

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现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (10) : 118-123. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.10.020
科研与开发

透明质酸疏水自组装纳米粒制备及其负载淫羊藿苷抗神经炎症研究

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Preparation of self-assembled hydrophobic hyaluronic acid-based nanoparticles and study on their loading icariin for curing neuroinflammatory

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摘要

利用透明质酸与全反式维甲酸的酯化反应合成透明质酸维甲酸酯(HARA)。HARA接枝率经高效液相色谱(HPLC)检测计算,由响应面实验优化接枝度,得到的HARA接枝度为0.905 μg/mg。淫羊藿苷(ICA)冰片(BO)芳香纳米粒(HARA/ICA-BO)采用薄膜分散法制备,通过粒度分析仪和透射电镜检测,粒径为296.52±4.56 nm,PDI为0.255±0.021;表面带负电荷,电位为(-15.07±0.04)mV。HPLC检测ICA的包封率和载药量分别为79.61%±0.95%和4.09%±0.04%。利用小胶质细胞考察纳米粒对细胞存活率的影响,结果表明在10 μmol/L浓度下无细胞毒性。脂多糖(LPS)干预构建小胶质细胞炎症模型,在同浓度HARA/ICA-BO处理后显著抑制了炎症因子IL-6、COX-2、TNF-α和iNOS-2的mRNA表达。因此HARA/ICA-BO对体外神经炎症有显著治疗效果,具有潜在应用价值。

Abstract

Hyaluronic acid retinoate (HARA) is synthesized through the esterification reaction between hyaluronic acid and all-trans retinoic acid.The grafting rate of HARA is calculated by HPLC detection.The grafting rate of HARA obtained reaches 0.905 μg/mg after its grafting rate is optimized via response surface experiment.Epimedoside (ICA) borneol (BO) aromatic nanoparticles (HARA/ICA-BO) are prepared via the thin-film dispersion method,and detected by particle size analyzer and transmission electron microscope.The particle size is 296.52±4.56 nm,and the PDI is 0.255±0.021.The surface of HARA/ICA-BO nanoparticles carries with negative charges,and the potential is -15.07±0.04 mV.The encapsulation efficiency and loading capacity of ICA detected by HPLC are 79.61%±0.95% and 4.09%±0.04%,respectively.Microglial cells are taken to examine the impact of HARA/ICA-BO nanoparticles on cell viability,and the results show that there is no cytotoxicity at a HARA/ICA-BO concentration of 10 μmol/L.Lipopolysaccharide (LPS) is employed to intervene to construct a microglial inflammation model.After the microglial inflammation is treated by HARA/ICA-BO at the same concentration,the mRNA expressions of inflammatory factors such as IL-6,COX-2,TNF-α and iNOS-2 are significantly inhibited.Therefore,HARA/ICA-BO has a significant curing effect on in-vitro neuroinflammation and shows potential application value.

Graphical abstract

关键词

透明质酸 / 神经炎症 / 纳米载体 / 淫羊藿苷

Key words

hyaluronic acid / neuroinflammation / nano-carrier / icariin

Author summay

杨月蕙(1999-),女,硕士生,研究方向为天然产物与药物递送,.

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杨月蕙,杨晨,杨思敏,彭效明,管洁,居瑞军. 透明质酸疏水自组装纳米粒制备及其负载淫羊藿苷抗神经炎症研究[J]. , 2025, 45(10): 118-123 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.10.020

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透明质酸[(C14H20NO11Na)n,HA]是一种葡聚糖醛酸,具有提高药效、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的作用[1]。透明质酸分子中存在大量羟基,可用于疏水修饰,制备两亲性多糖,进而构建多糖纳米粒。纳米粒作为一种药物递送系统,因其能够有效包封药物、增强药物稳定性、提高药物靶向性、延长药物半衰期,从而显著提升治疗效果而被广泛应用。全反式维甲酸(ATRA)为维生素A的代谢产物,在细胞增殖、分化、凋亡、免疫、神经功能等方面均具有重要作用[2]。但血脑屏障(BBB)的存在阻碍治疗药物递送到脑内[3],导致药物活性成分在脑部的生物利用度低。冰片(BO)是一种具有芳香性的脂溶性双环单萜,有抑菌抗炎等作用[4],可以协助跨越血脑屏障,增加大脑对药物的吸收[5]。
神经炎症是指发生在中枢神经系统中的免疫反应,主要由胶质细胞的活化和外周免疫细胞侵入引起,并伴随有毒物质的释放。这会导致神经细胞功能障碍、死亡以及神经系统退行性变化,最终可能发展为多种神经系统退行性疾病。淫羊藿苷(ICA)具有广泛的药理活性,能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢,具有保护神经元、抗衰老、抗肿瘤等功效[6-9]。研究表明,ICA抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)[10]、白细胞介素-6(IL-6)[11]的mRNA表达,并且对诱导型一氧化氮合酶(iNOS-2)[12]也有抑制效果。其中IL-6常用于评估机体免疫功能,突显了它在免疫反应中的重要作用,同时也是潜在的治疗靶点[13-14]。因此通过ICA对白细胞介素和肿瘤坏死因子的抑制,可以有效减少神经炎症的发生,从而减缓认知行为障碍。ICA具有脂溶性,生物利用度低、稳定性差,这些问题限制了其治疗效果[15]。将ICA与BO共同包入纳米粒可以改善ICA的生物利用度,同时增强纳米粒的跨越血脑屏障能力,从而保护神经细胞,减少炎症反应。
本研究通过酯化反应将HA与ATRA相连接,构建一种两亲性多糖,通过高效液相色谱(HPLC)检测其接枝率。再通过单因素实验筛选影响接枝率的反应条件,在此基础上构建响应面模型,预测最佳接枝率。纳米粒通过薄膜水化法制备,将抗炎药物ICA与芳香性药物BO包入纳米粒,得到HARA/ICA-BO芳香纳米粒,以提高ICA的生物利用度,增强纳米粒跨越血脑屏障能力,通过小胶质细胞(BV2)评价其抗神经炎症能力和相关机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

淫羊藿苷、透明质酸、冰片,大连美仑生物技术有限公司;小鼠小胶质细胞BV-2,北京亿奥邦公司;逆转录试剂盒,武汉赛维尔公司;CCK-8试剂盒、DMEM培养基,北京亿奥邦公司;脂多糖、全反式维甲酸,北京索莱宝公司。
R-1005旋转蒸发器,郑州长城科工贸有限公司;JY96-IIN超声波粉碎机,东莞洛泰公司;e2695高效液相色谱仪,美国Waters公司;Thermo Nicolet IS5傅里叶变换红外光谱仪,美国Thermo Fisher公司;InfiniteF50酶标仪,瑞士Tecan公司;聚合酶链反应(PCR)仪,伯乐生命医学产品有限公司;NanoBrook 90Plus Zeta粒度仪,美国Brookhaven公司。

1.2 HARA的合成与表征

取600 mg ATRA(ATRA与HA的摩尔比为50∶1)、1030 mg二环乙基碳二甲胺(DCC)、48.8 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)常温避光溶解于25 mL二甲基甲酰胺(DMF)中,加入三乙胺调节至pH=9;将500 mg透明质酸钠溶于20 mL纯水,加入1 g吐温80,搅拌至均匀分散;将有机相缓慢滴入到水相中,室温反应24 h。反应结束后过滤,滤液转移至8 000~14 000 Da透析袋中,蒸馏水透析48 h。再次过滤,滤液部分加入到5倍体积的95%乙醇中,4℃醇沉过夜。以1 500 r/min的转速离心10 min,取下层沉淀部分,加少量水复溶,冻干得到修饰产物。通过 FT-IR及HPLC对产物结构进行分析。

1.3 HARA的接枝率检测

利用液相色谱检测ATRA含量。色谱条件为:waters e2695液相色谱,PDA 2998紫外检测器;凝胶色谱柱,流动相为甲醇-1%冰醋酸(体积比为8∶2),等度洗脱,流速0.8 mL/min,波长305 nm,进样 10 μL。
标准品溶液配制与检测:准确称量0.93 mg ATRA标准品,加入少量甲醇溶解,转移至10 mL容量瓶,再次加入甲醇至刻度线摇匀备用。将配制好的溶液梯度稀释,分别进样,以质量为x,峰面积为y建立标准曲线。
样品溶液配制与检测:取10 mg HARA用2 mL纯水溶解,过0.45 μm滤膜,打入液相检测,将峰面积带入标曲,计算其中ATRA实际质量(μg)、计算接枝率,如式(1)所示。
$\begin{array}{l}接枝率=\left[\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{R}\mathrm{A}实际质量\right(\mathrm{\mu }\mathrm{g})/\\ 总质量\left(\mathrm{m}\mathrm{g}\right)]\times 100\mathrm{\%}\end{array}$

1.4 合成反应单因素试验

分别控制反应温度、反应时间、反应物与HA配比为唯一变量,考察3种因素对HARA接枝率的影响。各因素水平见表1。

1.5 响应面优化

由单因素实验确定影响HARA接枝率的主要因素为ATRA与HA摩尔比(A)、反应时间(B)、反应温度(C)。以接枝率为主要参考下表标准,每个因素选择3个水平进行响应面试验,通过Design Expert 13软件进行数据分析。各因素水平见表2。

1.6 HARA/ICA-BO的制备

利用HARA包载淫羊藿苷ICA与冰片BO制备载药纳米粒HARA/ICA-BO。取10 mg HARA溶解于30 mL甲醇;取1 mg ICA与1 mg BO,各用1 mL甲醇溶解,分别取0.5 mL加入到HARA甲醇溶液中。混合均匀并超声20 min,将溶液转移至圆底烧瓶中,于30℃、压力0.01 MPa的条件下旋蒸30 min蒸干溶剂,随后加入纯水5 mL,于40℃旋转加热 30 min使薄膜溶解。然后用探头超声5 min得到HARA/ICA-BO。(HARA空白纳米粒制备时不添加ICA和BO)。

1.7 HARA/ICA-BO粒径、PDI及电位检测

通过粒度仪检测HARA及HARA/ICA-BO的粒径、PDI与电位。

1.8 HARA/ICA-BO包封率与载药量检测

以ICA为考察标准考察HARA/ICA-BO的包封率。用HPLC检测ICA含量,色谱条件为:使用C18色谱柱,流动相为乙腈和30 mmol/L磷酸二氢钾溶液,梯度洗脱(0~10 min,20%乙腈;11~60 min,35%乙腈),流速1 mL/min,波长为270 nm,柱温30℃,进样量为10 μL。配制不同浓度的ICA标准品溶液,利用上述方法测定峰面积绘制标准曲线,由标准曲线计算ICA含量。
以ICA为考察标准,评价载药纳米粒的包封率与载药量。取1 mL HARA/ICA-BO溶液,过0.45 μm滤膜,以1∶1的体积比加入甲醇,超声5 min裂解,随后进样检测ICA含量,记为m。另取1 mL HARA/ICA-BO溶液,直接以1∶1的体积比加入甲醇,超声5 min裂解,进样检测ICA含量,记为M,根据式(2)、(3)计算包封率和载药量。
$包封率=\left(\frac{m}{M}\right)\times 100\mathrm{\%}$
$载药量=\left(\frac{m}{总质量}\right)\times 100\mathrm{\%}$
式中,m为包封的ICA质量,mg;M为HARA/ICA-BO中ICA总含量,mg。

1.9 细胞存活率测试

BV2细胞培养条件为DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS)+1%双抗,放置在37℃、体积分数5% CO2的培养箱。取对数期生长的BV2细胞消化离心后接种于96孔板,以1×104个细胞每孔铺板,过夜培养。分组如下:空白组(只含有等体积的培养基溶液),对照组(不含药物,只含细胞),实验组(含有细胞和药物,给药浓度分别为0.156、0.312、0.62、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)。培养24 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,放于培养箱中静置 1 h后,在450 nm波长处测定吸光度(OD值)。根据式(4)计算细胞活力。
$\begin{array}{l}计算细胞活力=(实验组吸光度-空白组吸光度)/\\ (对照组吸光度-空白组)\times 100\mathrm{\%}\end{array}$

1.10 抗炎因子表达量检测

按照“1.9”项下方法培养细胞后用LPS建立炎症模型,取对数期生长的BV2细胞,消化离心后,以6×105个细胞/孔接种于6孔板中,置于孵箱中培养12 h后,分为5组进行实验,分组如下对照组正常培养细胞12 h;模型组添加1 μg/mL LPS处理6 h;实验组分为低中高3个给药剂量组,浓度梯度依次为0.1、1、10 μmol/L,处理6 h后再添加1 μg/mL LPS,共同孵育6 h。
提取细胞RNA采用Trizol法,测定RNA浓度后逆转录为cDNA。以GAPDH为内参,将配制好的溶液置于PCR仪上进行反应,用荧光定量PCR法检测炎症基因如IL-6、COX-2、TNF-α和iNOS-2的mRNA表达水平。

1.11 统计学分析

通过GraphPad Prism 9软件进行作图,计量资料以( $\stackrel{-}{x}$±s)表示,两组间比较用最小显著差异法。

2 结果与分析

2.1 HARA的合成与表征

HA与HARA的红外光谱对比图见图1。代表ATRA的特征峰为2 932 cm-1处甲基的特征吸收峰和1 658 cm-1处羧基中C=O的特征吸收峰;在图中,2 855 cm-1处为HA中CH的伸缩振动峰,3 392 cm-1处属于羟基OH峰,比对发现OH峰经过反应后峰面积缩小,说明反应成功发生,并消耗了大量OH基团。
ATRA、HARA与HA在350 nm处的紫外光谱图如图2所示。其中ATRA在350 nm处有最大吸收峰;HARA同样在350 nm处出现吸收峰;HA在350 nm无吸收峰。由此可见,当ATRA与HA发生反应,使其在350 nm处出现吸收峰,说明合成反应成功发生。

2.2 HARA的接枝率检测

ATRA标准曲线方程为y=5 000 000x-175 879,R2=0.999 6,相关度良好,线性范围为0.093~2.79 μg。通过计算发现HARA接枝率为0.72 μg/mg。

2.3 合成反应单因素实验

控制反应温度为唯一变量,当反应温度分别为25、30、40、50℃时,接枝率依次为0.75、0.77、0.78、0.71 μg/mg。推测温度升高,使得反应物活性增加,分子间碰撞次数增加,接枝率增大;当反应温度过高时,ATRA与HA会分解,导致接枝率降低。
控制反应时间为唯一变量,当反应时间分别为12、24、48、72 h时,接枝率依次为0.62、0.76、0.81、0.79 μg/mg。随着反应时间延长,酯化程度逐渐提高,当时间达到48 h时,反应达到平衡,接枝率不再增加。
控制ATRA与HA的摩尔比为唯一变量,当比例分别为25∶1、50∶1、75∶1、100∶1时,接枝率依次为0.68、0.77、0.81、0.72 μg/mg。当ATRA浓度增大,酯化程度增加,接枝率增加,当ATRA与HA摩尔比为75∶1时接枝率达到最高。

2.4 响应面实验

在单因素试验基础上,利用Box-Behnken进行实验设计并利用Design Expert软件进行数据分析,以接枝率为响应值,研究ATRA与HA摩尔比(A)、反应时间(B)和反应温度(C)3个因素对HARA接枝率的影响,响应面实验结果见表3。
采用Design Expert软件对响应面数据进行分析,得到回归方程为:Y=0.917 4-0.006 5A-0.003 5B-0.002 5C-0.009 3AB-0.018 7AC-0.000 7BC-0.048 1A2-0.034 6B2-0.037 6C2。由表4的ANOVA方差分析可知,模型相关系数R2=0.989 6,Radj=0.969 8,实验数据与模型拟合度较好,可以用该模型分析和预测芳香脂质体的最佳制备工艺。
HARA合成反应响应曲面见图3。由图可见,ATRA与HA摩尔比(A)、反应时间(B)和反应温度(C)对HARA接枝率影响效果依次为,A>C>B。
经过优化后的最佳方案为:取311.1 mg ATRA、534.0 mg DCC、25.3 mg DMAP,常温溶解于15 mL DMF中,加入2 mL三乙胺调节pH至弱碱性;将200 mg透明质酸钠溶于25 mL纯水中,加入1 g吐温80,搅拌至均匀分散;将有机相缓慢滴入到水相中,改变反应温度为40.4℃,反应时间46.7 h。由此得到的接枝率最高为0.918 μg/mg,经过验证发现实际接枝率为0.905 μg/mg,与预测值接近,说明建立的模型符合预期,具有参考价值。

2.5 HARA/ICA-BO粒径、PDI及电位分析

HARA及HARA/ICA-BO的平均粒径、PDI与电位值见表5。结果说明HARA在装载药物后,疏水核心增大,导致粒径增加;PDI与电位的减少则说明载药之后的纳米粒更加稳定,分布更加均匀。

2.6 HARA/ICA-BO的包封率与载药量

得到ICA的标准曲线为y=0.000 06x-7.912 1,R2=0.998 9,线性关系良好。HARA/ICA-BO的包封率为79.61%±0.95%,载药量为4.09%±0.04%。

2.7 细胞存活率试验

淫羊藿苷芳香纳米粒对BV2细胞的活性影响如图4所示,可以看出淫羊藿苷在0~20 μmol/L对BV2细胞并未表现出毒性;冰片在最高给药浓度时对BV2细胞均未表现出毒性。HARA和HARA/ICA-BO在实验范围内未对细胞产生明显毒副作用。

2.8 抗炎因子表达量检测

本研究为进一步探讨HARA/ICA-BO的抗炎机制,使用RT-qPCR分析IL-6、COX-2、TNF-α、iNOS-2等抗炎基因的mRNA表达水平。结果如图5所示,与对照组相比,模型组炎症因子(IL-6、COX-2、TNF-α、iNOS-2)的mRNA表达显著升高; 与模型组相比,HARA/ICA-BO纳米粒各剂量组均显著抑制上述炎症因子的mRNA表达。在给药浓度为10 μmol/L时,对LPS诱导产生的炎症抑制效果最强,表明该浓度下的HARA/ICA-BO具有最佳的抗炎效果。差异具有统计学意义。

3 结论

本研究通过酯化反应将透明质酸与全反式维甲酸相连接,通过FT-IR和HPLC表征结果确认了合成反应的成功,HARA的接枝率通过HPLC检测。通过单因素实验确定影响HARA接枝率的3个因素为ATRA及HA配比(A)、反应时间(B)、反应温度(C),通过Design Expert 13软件设计合成反应的响应面实验,并进行数据分析,拟合响应曲面。由曲面预测最佳接枝率为0.918 μg/mg,经验证发现实际接枝率为0.905 μg/mg,与预测值接近,具有参考价值。采用薄膜水化法制备载药纳米粒HARA/ICA-BO,利用粒度仪检测其粒径、PDI及电位,发现其粒径为296.52±4.56 nm,PDI为0.255±0.021,纳米粒带负电,电位为(-15.07±0.04)mV。通过HPLC检测,HARA/ICA-BO的包封率与载药量分别为79.61%和4.09%。细胞分子生物学实验表明,HARA/ICA-BO在20 μmol/L浓度下不具有细胞毒性,展现出良好的细胞活力,通过下调了IL-6、COX-2、TNF-α和iNOS-2的mRNA表达。该纳米载药系统展示了良好的抗炎潜力,为抗神经炎症保护提供了新的可能。

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基金资助

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