现代化工

现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (7) : 12-17. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.07.003

技术进展

Clostridium利用合成气发酵生产生物燃料和化学品的研究进展

何春 ¹ ,
许梦莹 ¹^,² ,
李炼 ¹^,³ ,
王玉洁 ¹ ,
王文豪 ⁴ ,
张甜 ¹^,³^,⁴^,^*

作者信息 +

Progress in production of biofuels and chemicals from syngas fermentation by Clostridium

Chun HE ¹ ,
Meng-ying XU ¹^,² ,
Lian LI ¹^,³ ,
Yu-jie WANG ¹ ,
Wen-hao WANG ⁴ ,
Tian ZHANG ¹^,³^,⁴^,^*

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摘要

综述了利用自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)进行合成气发酵生产生物燃料和化学品的最新进展。自产乙醇梭菌是一种严格厌氧的革兰氏阳性菌通过Wood-Ljungdahl途径进行代谢,主要生成乙醇和乙酸。重点介绍了合成气发酵工艺的多方面优化,包括培养基组分优化、工艺参数调整、微生物光电催化系统构建、微生物共培养系统等方面,这些技术进一步推动了该领域的发展。最后提出了当前研究存在的不足,并对未来的研究方向做出了展望,旨在为微生物合成气发酵在生物燃料和化学品生产领域提供参考。

Abstract

This paper reviews the latest advances in using Clostridium autoethanogenum to perform syngas fermentation for the production of biofuels and chemicals.Clostridium autoethanogenum is a strictly anaerobic Gram-positive bacterium metabolized via the Wood-Ljungdahl pathway to produce ethanol and acetic acid.This paper highlights the multifaceted optimization of the syngas fermentation process,including the optimization of medium components,the adjustment of process parameters,the construction of microbial photoelectrocatalytic system,microbial co-cultivation system,and the application of genetic engineering,which have further advanced the development of the field.Finally,the shortcomings of the current research are presented,and the future research directions are prospected,aiming to provide a reference for microbial syngas fermentation in the field of biofuels and chemicals production.

Graphical abstract

关键词

自产乙醇梭菌 / 基因工程 / 乙醇 / 发酵 / 合成气

Key words

Clostridium autoethanogenum / genetic engineering / ethanol / fermentation / syngas

Author summay

何春(2001-),男,硕士生。

引用本文

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何春,许梦莹,李炼,王玉洁,王文豪,张甜. Clostridium利用合成气发酵生产生物燃料和化学品的研究进展[J]. , 2025, 45(7): 12-17 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.07.003

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由于全球人口的不断增加和工业生产活动的加剧,人们一直探索可再生能源及其生产方式。其中,合成气发酵是一项很有前途的技术,是指微生物利用还原性气体如一氧化碳(CO)、氢气(H₂)与二氧化碳(CO₂)等一起发酵生产^[1]。该技术运行条件温和,且所采用的微生物催化剂成本相对较低。此外,合成气发酵无需固定的H₂/CO比例,因此原料来源极为广泛。合成气能够转化为多种有价值的碳基产品,除了生产乙醇,还能生产甲烷、乙酸以及丁醇等高级醇类^[2]化合物,为能源和化工领域提供了多元化的产品选择。

目前为止,已有公司在合成气发酵方面取得了较大进展,例如3家外国公司Coskata、INEOS Bio、anzaTech已经实现了合成气发酵生产液体燃料商业化,都有相应的示范工厂正在运行^[3]。此外,国内合成气发酵的应用也取得了显著进展,例如2023年初成立了一家南京食气生化科技有限公司,该公司以工业废气为原料,通过食气梭菌合成气发酵生产多种产品,主要以高级醇丁醇为主,预计每年可为环境减少100万t碳排放。

自产乙醇梭菌利用合成气发酵的主要产物为乙醇和乙酸,因可以减少废气中碳的排放,且在野生型状态下生产乙醇能力相对较高的优点,是一种研究潜力巨大的菌种,已在合成气发酵产生物燃料和高附加值化学品上被广泛研究,鉴于此,本文中分别从培养基组分、工艺参数、微生物光电催化系统、微生物共培养系统以及基因工程方面总结分析了自产乙醇梭菌合成气发酵生产生物燃料和化学品的最新进展。

1 自产乙醇梭菌

自产乙醇梭菌(DSM 10061)是一种严格厌氧的革兰氏阳性杆状细菌,可以用作碳和能源物质包括CO、CO₂和H₂、果糖等。自产乙醇梭菌在合成气发酵中主要产物为乙酸和乙醇,次要产物为乳酸、2,3-丁二醇等。乙醇作为更受关注的代谢产物,合成途径有2条:直接途径(AdhE途径)和间接途径(AOR途径)^[4]。直接途径以乙酰辅酶A为底物,由双功能醛/醇脱氢酶(AdhE)、CoA依赖性乙醛脱氢酶(Ald)和乙醇脱氢酶(Adh)参与催化,经由中间体乙醛两步合成乙醇;间接途径则是乙酸通过醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(AFOR)作用还原为乙醛,乙醛再通过乙醇脱氢酶作用合成乙醇(图1)。

2 自产乙醇梭菌合成气发酵的优化途径

2.1 工艺参数优化

2.1.1 培养基及合成气组分优化

在合成气发酵中,培养基成分以及气体成分是影响微生物代谢的重要基础因素。Valgepea等^[5]的研究表明,补充H₂可将乙醇/乙酸盐的摩尔比提高5倍,使乙醇通量成比例增加(15%比61%)。Oliveira等^[6]研究了添加

NH 4 +

、H₂S和

NO 3 -

对自产乙醇梭菌生长和乙醇生产的影响。研究发现任何含量的铵和硝酸盐的添加都会抑制梭菌的生长,并降低最终的乙醇浓度。Rueckel等^[7]将自热气流床气化炉产生的生物合成气进行清洁以降低CH₄、O₂、NH₃、H₂S、NO_x和HCN浓度,最终与使用相应人工合成气混合物的参考过程相比,使用纯化的生物合成气,自产乙醇梭菌的乙醇生产能力甚至得到了改善。

Bohye等^[8]在探究果糖、NH₄Cl和K₂HPO₄作为自产乙醇梭菌细菌生长和乙醇生产的影响因素时,发现当使用少量酵母提取物(0.5 g/L)时,乙醇的生产率更高,但当果糖浓度高于基础培养基(5 g/L)时,乙醇产量下降。NH₄Cl浓度对乙醇产量没有显著影响,但是在30 g/L时细菌生长受到抑制。Im等^[9]研究了维生素B12组分浓度对生产乙醇的影响,发现使用0.1 mg/L浓度的维生素B12使乙醇产量比使用基本培养基浓度(10 mg/L)增加了245%。Im等^[10]还评估了其他维生素成分对乙醇生产的影响,在生物素和叶酸浓度分别以0.2、2、20、100 μg/L为浓度梯度的培养实验中,发现分别添加0.2 μg/L的生物素和叶酸,可获得2.81 g/L和3.12 g/L的最大乙醇浓度。此外,在0.5 μg/L硫胺素-HCl下最终达到最大乙醇浓度为2.84 g/L。另外,Im等^[11]探究了钼、镍和钴组分浓度对自产乙醇梭菌乙醇生产的影响。当钼和镍浓度分别为0、0.001、0.01、0.1 g/L时,发现钼在0.001 g/L时乙醇产量略有增加;当镍浓度为0.001 g/L时乙醇产量比基础培养基浓度(0.01 g/L)的乙醇产量增加了26%。钴没有显示出对乙醇产量的促进作用,并且当钴超过0.18 g/L时抑制了细菌生长。An等^[12]对自产乙醇梭菌进行了浓度分别为0、0.001、0.01、0.1 μmol/L硒和钨的培养实验。发现在使用0.01 μmol/L硒和0.1 μmol/L钨的培养物中发酵获得最大乙醇浓度。Thi等^[13]评估了用相对低成本的营养补充剂替代酵母提取物的可能性,使用浓度为0.5 g/L的玉米浆、麦芽提取物和蔬菜提取物作为营养补充剂,自产乙醇梭菌最终乙醇浓度分别为2.24、3.37、3.76 g/L,与酵母提取物发酵的结果相当(乙醇浓度为2.16 g/L)。此外,Im等^[14]研究了有机氮补充剂对自产乙醇梭菌生长以及乙醇生产的影响。在分别添加0.5 g/L胰蛋白胨和0.5 g/L蛋白胨的培养物中,乙醇浓度达到最大水平4.57 g/L和4.23 g/L,产率分别提高了45.9%和44.3%。

以上研究了不同的成分及其浓度对自产乙醇梭菌乙醇产量的影响。表1是各类成分对自产乙醇梭菌乙醇产量的具体影响的总结。通过优化培养基和合成气成分,找出最优组合,以最大化乙醇的生产效率。

2.1.2 工艺技术及参数优化

合成气发酵除了培养基的影响外,操作条件也会对乙醇的生产产生较大影响。pH就是影响合成气发酵的主要因素之一。Abubackar等^[15]研究了在连续供应CO的反应器中pH对自产乙醇梭菌发酵的影响,当pH为6.0时,乙酸与乙醇产量差不多,分别为907.72 mg/L和910.69 mg/L,但当pH为4.75时,几乎不产生乙酸,乙醇产量仍可达867 mg/L,说明通过将pH从6.0降至4.75可以大大地提高乙醇/乙酸盐的摩尔比。此外,Abubackar等^[16]进一步研究了在连续的气体进料生物反应器中,进行pH循环(pH 5.75变为pH 4.75)。总共3次pH变换循环,最终导致了乙醇产量大量提高,达到了7 143 mg/L的浓度。

合成气发酵除必需的营养物质和pH外,另一个潜在瓶颈是由于CO等气体是微溶,导致了传质限制。Cotter等^[17]研究了在连续气体进料的生物反应器中以不同的流速(5、7.5、10 mL/min)为自产乙醇梭菌供应合成气,发现相较于5 mL/min(乙醇产量1.23 mmol/L)和7.5 mL/min(乙醇产量0.83 mmol/L),在10 mL/min流速下乙醇产量达到最大1.45 mmol/L。中空纤维膜能够更好地分散气体,增加气液传质速率,从而提高乙醇产量。Jang等^[18]研究了电解质对中空纤维膜中CO传质和乙醇生产的影响。与对照组相比,在含不同电解质溶液中CO最大传质速率为基础培养基的106%~339%。乙醇检测结果显示添加1% MgSO₄的电解质溶液则可以提高乙醇的产量,达到1.53 g/L,而不添加电解质溶液的对照组仅为1.35 g/L。

推进技术和提高产量关键是深入了解自产乙醇梭菌的代谢以及操作条件对发酵性能的影响。表2是各类工艺操作对自产乙醇梭菌的乙醇产量的影响的总结。这些发现对优化合成气发酵过程具有重要意义。

2.2 光催化和电催化

Rao等^[19]发现自产乙醇梭菌在光照条件下与黑暗条件下的细菌生产乙酸和乙醇存在较大差异,结果表明光照的刺激下,自产乙醇梭菌分别以合成气与果糖为碳源进行厌氧发酵合成乙醇的产量提高了1.8、2.2倍。在可见光的照射下,自产乙醇梭菌激活了其全部的乙醇生产路线,在一定程度上是为了加速乙酸盐的周转和限制细胞暴露于多因素的应激。

微生物电合成是一种新方法,旨在通过细胞外电子供应或利用生物电化学反应器阴极产生的电子将碳源还原成多碳化合物的生物过程。例如 Grimalt-Alemany等^[20]研究了将氧化还原电位(ORP)作为气体发酵过程中的控制参数。结果表明,使用稀H₂O₂将ORP增加到氧化条件下,乙醇生产率增加了3.7倍。Martinez-Ruano等^[21]进一步研究了中性红作为电子传递因素对自产乙醇梭菌电发酵期间生长的影响。结果表明当添加中性红时,乙酸产量提升至1.26 g/L,无中性红仅为1.02 g/L,但乙醇产量未发生显著变化。

最近,一种杂化光合系统被开发,即通过将光催化剂与微生物细菌进行耦合,从而提高生物化工产品的产量。Jin等^[22]开发了一种硫化镉纳米颗粒(CdS NPs)-自产乙醇梭菌杂化系统,最终乙酸产量为12.1 mmol/L,比不添加CdS时提高了3.8倍。因此,自产乙醇梭菌可以与光催化剂耦合,光驱动下光催化剂将还原当量转移到微生物催化剂上,提高合成气发酵效率(图2)。

以上研究通过利用光照和细胞外电子供应刺激自产乙醇梭菌的代谢活动,显著提高了乙醇和乙酸的生产效率。这些研究为优化生物燃料和化学品的生产提供了新的方法和思路。

2.3 微生物共培养

微生物共生体或人工微生物共培养物比单一培养物能完成更复杂的任务和承受更多变的环境。当使用合成气作为底物时,通过共培养系统可以扩大产品的范围。

自产乙醇梭菌也经常被用于在合成气中共培养。例如,Diender等^[23]建立了由自产乙醇梭菌和克式梭菌(DSM 555)组成的合成共培养物,克式梭菌通过利用自产乙醇梭菌合成气发酵产生的乙酸和乙醇,发酵产生了丁酸、己酸,同时自产乙醇梭菌可以利用丁酸、己酸生产丁醇及己醇,从而形成产物循环利用,最终通过链延伸将短链脂肪酸(SCFA)与乙醇转化为中链脂肪酸(MCFA)和高级醇,共培养物分别以8.5±1.1、2.5±0.63 mmol/(L·d)的速率产生丁酸盐和己酸盐,同时丁醇和己醇的产生速率分别为3.5±0.69、2.0±0.46 mmol/(L·d)。这种共培养为合成气生产中链脂肪酸和高级醇提供了一种替代方法。此外,Benito-Vaquerizo等^[24]还通过代谢模型设计了一种新的自产乙醇梭菌(DSM 10061)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的共培养方法,以从合成气中生产丁酸盐。拜氏梭菌是通过丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵生产MCFA和醇的微生物,其中乙酸盐是关键代谢物。通过实验建立了共培养体系,自产乙醇梭菌在合成气上生长,产生乙酸盐和痕量乙醇,同时拜氏梭菌依次消耗乙酸盐和乳酸盐,产生丁酸盐。

微生物共培养系统通过协同代谢和优化资源利用,实现了从合成气生产多样化的代谢产物。这些系统能够将短链酸或醇转化为中链脂肪酸和高级醇,为工业生物技术提供了新的生产路径。

2.4 工程菌株构建方法

转录、翻译等基因工程方法是提高细菌代谢产物产量的有力手段。自产乙醇梭菌的研究工作之前集中在通过合成生物学方法增强和扩展该细菌的产物形成。直至Humphreys等^[4]使用Illumina MiSeq(高通量测序)技术对自产乙醇梭菌(DSM 10061)进行了下一代测序,提出了一种可靠的自产乙醇梭菌全基因组序列,代表了这种自产乙醇梭菌在相关的工业操作和代谢建模上迈出了重要一步。Nwaokorie等^[25]研究了假设蛋白基因(hp)和CooT镍结合蛋白基因(nbp)对自产乙醇梭菌(DSM 10061)固定单碳气体的影响,通过使用CRISPR/nCas9靶向删除hp或nbp,发现删除hp或nbp的突变体表现出显著的生长缺陷且乙酸和乙醇产量均较低,而CO₂碳通量和生物量均较高,说明这2个基因在碳固定和代谢的调控中起重要作用。

Agr(accessory gene regulator)群体感应系统是一种细菌的细胞间通信机制,通过分泌和感知信号分子,协调群体内的基因表达和行为。Piatek等^[26]通过编码自产乙醇梭菌(DSM 10061)agrD1和agrD2的信号分子靶向缺失。发现任一基因的单个缺失均未产生明显的代谢区别。然而,当2个基因同时失活时,双突变体的最终产物浓度对照原始菌株的最终产物浓度,发现乙醇∶乙酸盐从0.2∶1的比例转变为1.5∶1,使乙醇成为主要的发酵产物。表明,Agr群体感应对Wood-Ljungdahl途径起调节作用。

Lemgruber等^[27]设计并表征了重组具有生产聚-3-羟基丁酸酯(PHB)相关基因的自产乙醇梭菌(DSM 10061)菌株,为自产乙醇梭菌合成气发酵增加了一种新型的代谢产物。Dykstra等^[28]也通过在自产乙醇梭菌上异源表达醇乙酰转移酶(AAT)从合成气发酵中产生乙酸乙酯,证明了从C₁原料自养发酵生产短链酯是可能的。Bourgade等^[29]设计了一种新型的双质粒系统实现了自产乙醇梭菌(DSM 10061)乙二醇(EG)的生产。Nogle等^[30]使用3个基因组序列数据集为DSM10061(JA1-1)型菌株组装了一个5.5 kb的pCA质粒。使用天然质粒复制起点将硫解酶(thlA)、CoA转移酶(ctfAB)和乙酰乙酸脱羧酶(adc)基因引入载体中,最终在自产乙醇梭菌中生产异丙醇。

上述研究通过对自产乙醇梭菌的基因组编辑和测序,揭示了在代谢途径中关键基因的作用,奠定了代谢工程的基础。其次利用代谢工程和合成生物学方法,引入和优化新的代谢路径,使自产乙醇梭菌能够生产多种高附加值的化学品。以上这些研究不仅提高了自产乙醇梭菌发酵的效率和产物产量,也为工业生物技术的发展提供了新的方法和思路。

3 结论与展望

近年来,利用自产乙醇梭菌进行合成气发酵在生物燃料和高附加值化学品生产方面取得了显著进展。本文中重点介绍了通过培养基组分优化和工艺参数调整,特别是在维生素、重金属离子浓度、合成气成分及pH的控制上。其次探讨了微生物光电催化系统对自产乙醇梭菌的影响。通过将光催化剂与自产乙醇梭菌耦合,有效提升了系统的能量转化效率。另外,微生物共培养系统使自产乙醇梭菌能够利用更多种类的碳源,扩大应用范围。最后,通过基因编辑和代谢工程手段,研究人员已成功改造自产乙醇梭菌,以优化代谢途径,提高目标产物的生成量。

未来在自产乙醇梭菌合成气发酵研究中,应着重以下几个方向:优化微生物共培养系统,研究不同微生物群落在合成气环境中的代谢协同效应,开发高效的人工共培养体系,以扩大产品范围,提高发酵效率。提升光合作用系统的稳定性和效率,探索新型光催化材料与自产乙醇梭菌的耦合机制,提高光能利用率,降低系统成本,并在实际应用中验证其可行性。结合代谢工程和合成生物学技术,设计和构建功能更强大、适应性更广泛的自产乙醇梭菌菌株,实现特定产品的高效合成。优化乙醇合成途径和其他高附加值化学品的合成路径,提高代谢效率。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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