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透明质酸疏水自组装纳米粒的制备及其负载虎杖苷的抗氧化活性研究

杨晨 ,  杨月蕙 ,  杨思敏 ,  彭效明 ,  管洁 ,  居瑞军

现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (6) : 164 -168.

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现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (6) : 164-168. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.06.028
科研与开发

透明质酸疏水自组装纳米粒的制备及其负载虎杖苷的抗氧化活性研究

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Preparation of hydrophobic self-assembled hyaluronic acid-based nanoparticles and study on their antioxidant activity in loading with polydatin

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摘要

通过透明质酸与硬脂酸的酯化反应合成透明质酸硬脂酸酯(HASA)。采用薄膜水化法制备HASA空白与载药纳米粒,将虎杖苷包入纳米粒中,通过引入薄荷醇提高纳米粒跨越血脑屏障能力,最终制备出HASA/PD-Men。利用透射电镜(TEM)、粒度仪对空白纳米粒和HASA/PD-Men的形态及粒径进行分析,并利用HT22细胞模型考察了纳米粒对细胞存活率的影响。结果表明,HASA/PD-Men在1 μmol/L浓度下不具有细胞毒性,且在相同浓度下显著上调了抗氧化基因Nrf2、SOD和HO-1的表达,显示出较强的抗氧化和神经保护潜力。HASA/PD-Men在保护神经细胞以及治疗脑部疾病中具有潜在的应用价值。

Abstract

Hyaluronic acid stearate (HASA) is synthesized through the esterification between hyaluronic acid and stearic acid.HASA blank and drug-loaded nanoparticles are prepared via thin film hydration method.Polydatin is encapsulated into the nanoparticles,and the ability of the nanoparticles to cross the blood-brain barrier is improved by adding menthol,and finally HASA/PD-Men are prepared.The morphology and particle size of blank HASA nanoparticles and HASA/PD-Men are analyzed by means of transmission electron microscopy (TEM) and particle size analyzer,and the influence of nanoparticles on cell survival rate is evaluated by using HT22 cell model.Results show that HASA/PD-Men has not cytotoxicity at 1 μmol/L,and significantly regulates up the expression of antioxidant genes such as Nrf2,SOD and HO-1 at the same concentration,showing strong antioxidant and neuro-protection potential.HASA/PD-Men has potential applications in the protection of nerve cells and the treatment of brain diseases.

Graphical abstract

关键词

透明质酸 / 神经保护 / 纳米载体 / 抗氧化活性 / 虎杖苷

Key words

hyaluronic acid / neuro-protection / nanocarrier / antioxidant activity / polydatin

Author summay

杨晨(2000-),男,硕士生,研究方向为天然产物与药物递送,。

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杨晨,杨月蕙,杨思敏,彭效明,管洁,居瑞军. 透明质酸疏水自组装纳米粒的制备及其负载虎杖苷的抗氧化活性研究[J]. 现代化工, 2025, 45(6): 164-168 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.06.028

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神经元是人体中最易受氧化应激影响的细胞之一。氧化应激由细胞代谢产生的活性氧(ROS)过度积累引起,导致神经细胞功能受损,增加神经退行性疾病的患病风险[1-3]。虎杖苷作为一种提取物来源于中药虎杖,是一种天然的抗氧化剂,具有清除自由基和调节抗氧化酶活性的潜力[4]。水溶性差和体内代谢快是限制虎杖苷临床应用的主要问题,通过将其制成纳米制剂可以解决上述问题,但传统的纳米制剂中会添加表面活性剂,使得纳米粒存在一定的细胞毒性。因此,开发低毒性虎杖苷纳米制剂很有必要。
透明质酸(HA)是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖单元构成的多糖,因其优异的生物相容性和丰富的修饰位点,广泛用于药物递送领域。冯旭晨等[5]用单油酸甘油酯修饰HA制备出一种两亲性聚合物,并用其负载阿霉素构建载药纳米粒,该纳米粒具有一定的pH敏感性及靶向抗肿瘤能力。透明质酸基纳米载体可以结合肿瘤细胞表面CD44受体,使得药物的靶向性增强、毒性减少。陈诗端[6]利用酯化反应将HA与青蒿琥酯结合,通过自组装形成纳米粒,体内实验证明该纳米粒可以通过CD44受体的特异性进入肿瘤细胞内,诱导肿瘤细胞凋亡。
血脑屏障(BBB)是一种生物屏障,可以选择性地过滤掉血浆中的溶质,在保护大脑的同时,也限制了药物的进入。研究发现,芳香类化合物具有引药上行的功效,可以增强BBB的通透性。Liang等[7]制备了薄荷醇修饰的BSA纳米粒,这种纳米粒具有跨越BBB的能力,使得药物特异性地积累在脑胶质瘤细胞内。
笔者以透明质酸疏水自组装纳米粒(HASA)为纳米递送载体、虎杖苷为抗氧化药物、薄荷醇为芳香剂,制备一种同时负载虎杖苷与薄荷醇的复合纳米粒,以此来改善虎杖苷的溶解性,提高跨越BBB能力,并用小鼠海马神经元细胞(HT22)评价其抗氧化能力及其相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

主要试剂:透明质酸钠(HA)、虎杖苷(Polydatin),大连美伦生物技术有限公司生产;硬脂酸(Stearic Acid),天津永大化学试剂有限公司生产;N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC),北京百灵威科技有限公司生产;4-二甲氨基吡啶(DMAP)、薄荷醇(Menthol)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、DMSO,上海阿拉丁生化科技有限公司生产;三乙胺、吐温80,国药集团化学试剂有限公司生产;DMEM培养基、磷酸盐缓冲溶液,中生奥邦生物科技研究有限公司生产;逆转录试剂盒,武汉赛维尔生物科技有限公司生产。
细胞系:小鼠神经元细胞HT22细胞,中生奥邦生物科技研究有限公司生产。
主要仪器:R-1005型旋转蒸发仪,郑州长城科工贸有限公司生产;JY96-IIN超声波粉碎机,东莞洛泰精密仪器有限公司生产;JEM-2100F型透射电子显微镜,日立高新技术公司生产;Thermo Nicolet IS5傅里叶变换红外光谱仪,美国Thermo Fisher公司生产;Bruker AVANCE Ⅲ 400M核磁共振光谱仪,德国Bruker公司生产;Waters Alliance e2695高效液相色谱仪,美国Waters公司生产;NanoBrook 90Plus Zeta粒度仪,美国Brookhaven公司生产;InfiniteF50酶标仪,瑞士Tecan公司生产;聚合酶链反应仪(PCR),伯乐生命医学产品有限公司生产。

1.2 透明质酸硬脂酸酯(HASA)的合成与表征

HASA的合成过程参考文献[8]并稍作改进。精密称量硬脂酸(1 420 mg)、N,N'-二环己基碳二亚胺(1 030 mg)和4-二甲氨基吡啶(48.8 mg)加入到20 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中超声溶解,加入1 mL三乙胺调节pH。取HA(500 mg)溶解于50 mL纯水中,加入2 g吐温80,搅拌均匀。在30℃条件下,将有机溶液逐滴加入到HA溶液中反应 48 h。反应结束后,过滤所得溶液,并将滤液转移至透析袋中(截留分子质量为8 000~14 000 Da),用纯水透析48 h,每8 h换水。透析液经95%乙醇溶液沉淀,4℃条件下静置过夜,收集沉淀后冷冻干燥得到HASA。通过傅里叶红外光谱仪(FT-IR)及核磁共振光谱仪(NMR)对产物结构进行分析。

1.3 HASA自组装纳米粒的制备

精密称量10 mg的HASA溶解于30 mL纯甲醇溶液,并将溶液转移至50 mL圆底烧瓶中。温度为40℃、压力为0.01 MPa条件下旋转蒸发40 min,于烧瓶底部形成均匀的白色薄膜。随后加入5 mL纯水,旋转加热40 min使薄膜完全溶解,超声探头处理5 min,得到HASA自组装纳米粒。制备好的溶液置于4℃保存。

1.4 虎杖苷与薄荷醇载药纳米粒(HASA/PD-Men)的制备

精密称量10 mg HASA溶解于20 mL纯甲醇溶液,随后加入虎杖苷(0.4 mg)与薄荷醇(0.1 mg)的甲醇溶液,使总体积为30 mL。将混合溶液转移至圆底烧瓶,温度为40℃、压力为0.01 MPa条件下旋转蒸发40 min,于烧瓶底部形成均匀的白色薄膜。加入5 mL纯水,旋转加热40 min使薄膜完全溶解,超声探头处理5 min,得到HASA/PD-Men自组装纳米粒。制备好的溶液置于4℃保存。

1.5 纳米粒的形态表征

通过粒度分析仪测定HASA空白及载药纳米粒的粒径及多分散指数(PDI)。通过透射电子显微镜(TEM)观察空白纳米粒HASA的形态,取30 μL新制备的纳米粒溶液滴于铜网上,静置并挥干水分,滴加磷钨酸溶液染色,并在红外灯下烘干10 min,上镜观察。

1.6 虎杖苷含量测定

利用高效液相色谱仪(HPLC)分析虎杖苷的含量,色谱条件为:C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速为1 mL/min,流动相A为23%乙腈,流动相B为77%纯水,柱温为30℃,检测波长为 306 nm,进样量为10 μL,运行时间为20 min。
标准品溶液的制备及检测:准确称取10.07 mg虎杖苷标准品溶解于10 mL甲醇中,梯度稀释,得到质量浓度为1.12~56 μg/mL的标准品溶液。标准品溶液按上述色谱条件打入液相。以标准品溶液质量浓度为自变量X(μg/mL),峰面积为因变量Y,建立标准曲线。
样品溶液制备及检测:取1 mL载药纳米粒溶液,按体积比1∶1加入甲醇裂解,用0.45 μm滤膜过滤,滤液部分按上述色谱条件打入液相。将所得的峰面积带入标准曲线,计算样品溶液中虎杖苷质量。

1.7 包封率与载药量测定

以虎杖苷为抗氧化药物,采用离心法测定载药纳米粒的包封率。取1 mL载药纳米粒溶液,加入 1 mL甲醇裂解,测定虎杖苷总质量(m)。另取 1 mL载药纳米粒溶液,12 000 r/min离心30 min,收集上清液,测定游离虎杖苷的质量(m0)。虎杖苷的包封率和载药量的计算式分别为:
虎 杖 苷 的 包 封 率 = [ ( 虎 杖 苷 总 质 量 - 游 离 虎 杖 苷 质 量 ) / 虎 杖 苷 质 量 ] × 100 %
载 药 量 = [ ( 虎 杖 苷 总 质 量 - 游 离 虎 杖 苷 质 量 ) / 载 体 与 药 物 质 量 和 ] × 100 %

1.8 细胞存活率测试

选用HT22细胞为模型,利用MTT法评估空白纳米粒、HASA/PD-Men、虎杖苷及薄荷醇的细胞毒性。将细胞接种于96孔板,细胞数为10 000个/孔,将孔板放入培养箱,培养条件为37℃、5% CO2。24 h后取出,向每个孔中加入含有不同浓度药物的培养基,再次放入培养箱中。24 h后取出,加入0.5% MTT溶液,孵育4 h,溶液吸出后加入DMSO溶液溶解结晶,于490 nm处检测吸光度。细胞存活率计算式为:
细 胞 存 活 率 = [ ( 样 品 孔 吸 光 度 - 空 白 吸 光 度 ) / ( 对 照 孔 吸 光 度 - 空 白 吸 光 度 ) ] × 1 00 %

1.9 抗氧化mRNA表达测试

使用Trizol法提取细胞总RNA,并将其逆转录为cDNA。通过RT-qPCR分析Nrf2、SOD、HO-1等抗氧化基因的表达变化,以GAPDH作为内参进行定量。

1.10 统计学分析

通过Graphpad prism软件分析细胞存活率与抗氧化mRNA表达测试结果,结果用平均数±标准差表示。2组数据对比采用单因素方差分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 HASA合成与表征

硬脂酸中的羧基与HA中N-乙酰氨基葡萄糖单元的羟基发生酯化反应,生成透明质酸硬脂酸酯(HASA)。HA与HASA的红外吸收光谱图如图1所示。从图1中可以看出,HASA在1 735 cm-1处出现新的吸收峰[9],归属于羰基的伸缩振动,说明反应生成了酯基。与未修饰的HA相比,HASA在 2 800~2 950 cm-1区域的C—H伸缩振动吸收峰显著增强,表明成功引入了长链烷基基团[10]。
HASA与HA的 1H-NMR图如图2所示。从图2中可以看出,HA中δ 2.02 ppm为甲基的质子峰,δ 3.2~4.0 ppm属于多糖碳骨架上的质子。HASA中δ 0.87 ppm处出现了新峰,属于硬脂酸链末端的甲基氢信号[11],δ 1.27 ppm处则对应于硬脂酸链中的亚甲基氢信号。结果说明硬脂酸成功接枝到HA分子上。

2.2 纳米粒的粒径与形态

通过薄膜水化法制备HASA自组装纳米粒,利用粒度分析仪测定了空白纳米粒的平均粒径和PDI,结果如表1所示。从表1中可以看出,空白纳米粒的平均粒径为234 nm,PDI为0.249,表明纳米粒分布均匀,具有良好的分散性。
HASA纳米粒的TEM图像与粒径分布如图3所示。从图3中可以看出,空白纳米粒呈规则的球形结构,粒径约为15 nm。这与粒度分析仪测得的粒径有所不同,这是由于TEM分析时样品处于干燥状态,而粒度分析仪测量的是溶液中的水合状态。此外,TEM图显示纳米粒表面光滑,无明显聚集现象,进一步验证了纳米粒的高均一性。
与空白纳米粒相比,HASA/PD-Men的平均粒径增大,分别为276 nm和388 nm。说明药物的包封增加了纳米粒的疏水核心尺寸,同时也影响了形态和稳定性。PDI的略微变化也暗示了药物包封对纳米粒分散性的影响。
HASA/PD-Men的高包封率和适宜的载药量说明,HASA有效地隔离了疏水性药物与外界环境,这对于提高药物的生物利用度和延长药效持续时间具有重要作用。

2.3 虎杖苷含量测定与包封率载药量检测

利用HPLC测定HASA/PD-Men中虎杖苷的质量。标准曲线的峰面积(y)与浓度(x)呈良好的线性关系,回归方程为y=267 315x-320 991,线性范围为1.12~56 μg/mL,相关系数R2=0.999 8。
以虎杖苷为抗氧化药物,采用离心法测定包封率和载药量,结果如表2所示。从表2中可以看出,HASA/PD的包封率为96.02%,载药量为4.64%;而HASA/PD-Men的包封率为95.25%,载药量为3.66%。高包封率和载药量显示出HASA/PD-Men在包封疏水性药物方面的有效性和稳定性。

2.4 细胞存活率测试

用MTT法对HT22细胞进行细胞毒性实验,评估不同浓度的虎杖苷、薄荷醇、空白纳米粒及 HASA/PD-Men对HT22细胞存活率的影响,结果如表3~6所示。从表6中可以看出,当HASA/PD-Men中虎杖苷浓度达到16 μmol/L时,细胞存活率超过85%;而相同浓度的空白纳米粒及虎杖苷中,细胞存活率分别在85%、95%以上。表明HASA/PD-Men在16 μmol/L的浓度范围内对细胞无显著毒性,显示出良好的安全性。

2.5 抗氧化mRNA表达测试

为了进一步探讨HASA/PD-Men的抗氧化作用机制,利用RT-qPCR分析Nrf2、SOD、HO-1等抗氧化相关基因的表达水平,结果如表7所示。从表7中可以看出,与对照组相比,在低至中等浓度下,HASA/PD-Men显著上调了Nrf2、SOD和HO-1的mRNA表达水平,显示出显著的抗氧化基因激活效应。尤其是在1 μmol/L浓度时,这些基因表达达到峰值,表明该浓度下的HASA/PD-Men具有最佳的抗氧化效果。
Nrf2是细胞内主要的抗氧化应答调节因子,其激活能增强细胞的抗氧化能力,减少ROS引起的细胞损伤[12]。HASA/PD-Men在1 μmol/L浓度下显著上调了Nrf2的表达,这是由于纳米粒释放的虎杖苷有效地激活了Nrf2通路,增强了细胞的抗氧化防御能力。SOD是一种抗氧化酶,可以将细胞代谢产生的活性氧转化为过氧化氢,从而减少ROS对细胞的损伤[13]。HO-1通过代谢产生具有抗氧化能力的产物,如胆红素和一氧化碳,进一步保护细胞免受氧化应激的影响[14]。结果表明,HASA/PD-Men能够通过多重途径增强细胞的抗氧化能力,具有潜在的神经保护作用。

3 结论

成功合成了透明质酸钠硬脂酸酯(HASA),通过FT-IR和NMR表征结果确认了硬脂酸的成功接枝。采用薄膜分散法制备HASA空白纳米粒与载药纳米粒HASA/PD-Men,利用粒度仪与透射电镜TEM对纳米粒进行表征,发现其结构呈现球形且分布均匀。通过离心法检测HASA/PD-Men的包封率与载药量分别为95.25%、3.6%。细胞分子生物学实验表明,HASA/PD-Men在1 μmol/L浓度下不具有细胞毒性,展现出显著的抗氧化活性,上调了Nrf2、SOD和HO-1等关键抗氧化基因的表达。该纳米载药系统展示了良好的抗氧化潜力,为保护神经细胞提供了新的可能。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用
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基金资助

国家自然科学基金项目(21406015)

北京市教委科技计划一般项目(KM202210017011)

北京市教委科技计划一般项目(KM202310017009)

北京石油化工学院校内学科平台建设项目(2019XK006)

北京石油化工学院交叉科研探索项目(BIPTCSF-2023008)

北京石油化工学院致远科研基金(2023013)

北京市科协青年人才托举工程项目(BYESS2023259)

大学生创新创业训练计划项目(2024J00293)

大学生创新创业训练计划项目(2024J00276)

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