现代化工

现代化工 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (9) : 194-200. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.09.033

科研与开发

具有免疫调节作用透明质酸纳米复合水凝胶的制备及性能研究

张煦显 ¹ ,
孙雯 ²^,^*

作者信息 +

Preparation and properties of an immunomodulatory hyaluronic acid nanocomposite hydrogel

ZHANG Xu-xian ¹ ,
SUN Wen ²^,^*

Author information +

文章历史 +

Received		Published
2026-05-21		2026-09-20
Issue Date	Revised Date
2026-09-10	2026-05-21

PDF (5743K)

摘要

针对皮肤伤口愈合过程中细菌感染、氧化应激及免疫失调等关键问题,设计了一种具有免疫调节功能的透明质酸纳米复合水凝胶。该水凝胶以接枝己二胺的透明质酸和醛基化透明质酸为骨架,通过Schiff碱交联反应原位形成凝胶,并在成胶过程中负载姜黄素@ZIF-8纳米颗粒。系统表征了2种透明质酸衍生物及纳米颗粒的结构,评价了水凝胶的形貌、流变学性能、组织粘附性、体外抗菌活性、溶血率、细胞毒性及促巨噬细胞M2极化能力。结果表明,该水凝胶兼具抗菌、抗氧化及免疫调节功能,有望为皮肤伤口修复提供新型材料平台。

Abstract

Aiming at the critical issues of bacterial infection,oxidative stress,and immune dysregulation during skin wound healing,this study designs an immunomodulatory hyaluronic acid (HA) nanocomposite hydrogel.The hydrogel was constructed using hexamethylenediamine-grafted HA and aldehyde-modified HA as the backbone,which formed an in situ gel via Schiff base crosslinking.Curcumin-loaded ZIF-8 (Cur@ZIF-8) nanoparticles were incorporated during the gelation process.The structures of the two HA derivatives and the nanoparticles were systematically characterized.The morphology,rheological properties,tissue adhesion,in vitro antibacterial activity,hemolysis ratio,cytotoxicity,and ability to promote macrophage M2 polarization of the hydrogel were evaluated.The results indicate that this hydrogel possesses antibacterial,antioxidant,and immunomodulatory functions,offering a promising material platform for skin wound repair.

关键词

透明质酸 / 纳米复合水凝胶 / 免疫调节 / 姜黄素 / ZIF-8

Key words

hyaluronic acid / nanocomposite hydrogel / immunomodulation / curcumin / ZIF-8

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张煦显(1971-),男,本科,工程师,研究方向为化工炼油领域的工艺过程应用和技术管理,1991013746@163.com。

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皮肤作为人体最大的器官,承担着物理屏障、免疫监视及感觉传导等重要生理功能。创伤、烧伤、手术切口及慢性疾病(如糖尿病)等因素可导致皮肤缺损,引发一系列复杂的愈合过程^[1-2]。理想的伤口愈合需经历止血、炎症、增殖及重塑4个相互重叠的阶段。然而,临床实践中皮肤伤口常面临3大核心挑战:第一,病原微生物易在潮湿的创面环境中定植和增殖,形成生物膜,导致感染迁延不愈,严重时可引发脓毒症^[3-4];第二,伤口局部过度产生的活性氧(ROS)会引发氧化应激,损伤细胞膜、DNA及功能蛋白,阻碍修复进程^[5-6];第三,免疫细胞(尤其是巨噬细胞)功能失调,导致炎症反应无法从促炎的M1表型适时切换至抗炎促愈合的M2表型,造成慢性炎症和组织纤维化^[7-8]。因此,开发一种能够同时应对细菌感染、缓解氧化应激并主动调节免疫微环境的新型伤口敷料,具有重要的临床意义和科学价值^[9]。

水凝胶因其三维网络结构、高含水量、良好的生物相容性及可调的理化性质,成为伤口敷料领域的研究热点^[10]。其中,透明质酸(hyaluronic acid)作为细胞外基质的重要组成成分,不仅参与维持组织水合作用,还能通过其受体(如CD44)调节细胞增殖、迁移及促进巨噬细胞向抗炎的M2表型极化,是构建伤口修复材料的理想骨架^[11-13]。然而,天然透明质酸缺乏足够的力学强度和可调控的交联位点。为此,本工作采用己二胺(hexamethylenediamine,HDA)接枝透明质酸得到氨基化衍生物(HA-ADH),以及使用高碘酸钠氧化透明质酸得到醛基化产物(HA-CHO),二者混合后即可通过Schiff碱反应形成动态共价交联网络,既赋予水凝胶可注射性和自愈合能力,又避免了外加交联剂的毒性风险。

为进一步增强水凝胶的功能性,将纳米材料与聚合物网络复合是一种有效策略^[14-15]。沸石咪唑酯框架材料(zeolitic imidazolate framework,ZIF-8)是金属有机框架的典型代表,具有高比表面积、易制备以及优良的药物负载能力^[16-17]。尤其值得关注的是,ZIF-8可以释放具有广谱抗菌活性的Zn²⁺。姜黄素(curcumin,Cur)是一种天然多酚化合物,不仅能够清除多种ROS,还能通过调控NF-κB等信号通路抑制炎症反应^[18]。将姜黄素负载于ZIF-8中所得载药纳米颗粒(Cur@ZIF-8)可实现抗菌Zn²⁺和抗氧化姜黄素的协同释放。加之透明质酸免疫调节的特性与Cur@ZIF-8的抗菌抗氧化作用相协同,有望从多维度调控伤口微环境。

基于上述设计思路,本研究制备了HA-HDA和HA-CHO两种透明质酸衍生物,通过核磁共振氢谱(¹H nuclear magnetic resonance,¹HNMR)验证其结构;合成了ZIF-8及Cur@ZIF-8纳米颗粒,利用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察其形貌。将上述组分混合后,即可通过Schiff碱交联形成纳米复合水凝胶,系统评价其微观形貌、流变学行为、组织粘附性能、体外抗菌活性、血液相容性(溶血率)及细胞毒性。特别地,通过体外巨噬细胞培养模型,验证了该水凝胶促进巨噬细胞向M2极化的能力。现有体外实验数据充分表明,该免疫调节透明质酸纳米复合水凝胶在协同抗感染、抗氧化及调控免疫反应方面展现出显著优势,有望成为促进皮肤伤口修复的新型功能敷料,为后续临床转化研究提供理论和材料基础。

1 实验部分

1.1 实验仪器

冷冻干燥机(FD-1C-50,北京博医康实验仪器有限公司),旋转流变仪(MCR 302,安东帕商贸有限公司),场发射扫描电子显微镜(SEM,SU8010,日本株式会社日立高新技术),紫外-可见分光光度计(UV-Vis,Cary100,安捷伦科技有限公司),核磁共振波谱仪(NMR,AVANCE NEO,布鲁克公司),万能材料试验机(HZ-1004,恒准仪器科技有限公司)。

1.2 实验试剂

透明质酸钠、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、HDA、2-甲基咪唑、六水硝酸锌、叔丁基卡巴肼、高碘酸钠、购自上海麦克林生化有限公司。2,4,6-三硝基苯磺酸购自Sigma公司。姜黄素(Cur)购自上海毕得医药科技股份有限公司。2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)购自上海皓鸿生物医药科技有限公司。猪红细胞购自源叶。所用溶剂及其他试剂购自成都科龙化学有限公司。

1.3 透明质酸衍生物的制备

1.3.1 己二胺化透明质酸的制备

将透明质酸钠(5 mmol重复单元)溶解于100 mL去离子水中,每隔0.5 h依次加入EDC(5 mmol)和NHS(5 mmol),再用1 mol/L的盐酸溶液调整pH至4。在室温下搅拌反应1 h后,加入HDA(5 mmol),再搅拌反应24 h。反应结束后溶液用MWCO 3 500 Da透析袋在0.1 mol/L pH为3.5的氯化钠溶液中透析2 d,再用去离子水透析1 d,将透析过的溶液冻干后即可得到己二胺化透明质酸(HA-HDA)。

1.3.2 醛基化透明质酸的制备

将透明质酸钠(5 mmol重复单元)溶解于100 mL去离子水中,然后加入高碘酸钠(4 mmol)避光反应 2 h。加入2 mL乙二醇继续反应1 h,所得反应液用MWCO 3 500 Da透析袋在去离子水中透析3 d,冻干后得产物醛基化透明质酸(HA-CHO)。

醛基含量使用叔丁基卡巴肼和2,4,6-三硝基苯磺酸进行测定^[19]。首先是HA-CHO与过量的叔丁基卡巴肼反应,然后加入2,4,6-三硝基苯磺酸测定未反应的叔丁基卡巴肼的含量,并计算出HA-CHO中醛基消耗的叔丁基卡巴肼的量,进一步得到醛基的含量。

1.4 Cur@ZIF-8的制备

将2-甲基咪唑(10 mmol)和15 mg Cur分散到10 mL甲醇中,室温超声30 min后加入六水硝酸锌(1 mmol),超声3 min,静置4 h。将反应液离心,使用甲醇洗涤3次,再使用去离子水洗涤3次。通过冷冻干燥得到Cur@ZIF-8,并储存在-20℃备用。使用相同方法不添加Cur制备ZIF-8。

1.5 水凝胶的制备

分别配置2种HA衍生物HA-HDA(50 mg/mL)和HA-CHO(50 mg/mL)的溶液备用。HA水凝胶:等体积的HA-HDA溶液和HA-CHO溶液混合均匀后静置1 h。HACZ水凝胶:先将Cur@ZIF-8(2 mg/mL)分散于HA-HDA溶液中,然后与等体积的HA-CHO溶液混匀后静置1 h。

1.6 水凝胶的结构和性能

1.6.1 表征方法

使用 ¹HNMR对产物的结构进行表征确认。使用SEM观察Cur@ZIF-8和冻干水凝胶的形貌。使用旋转流变仪测定水凝胶的流变学性能。通过在0.1~100 rad/s角频率范围内和1%恒定应变下的动态频率扫描测试水凝胶的粘弹性。连续交替应变扫描的大应变为500%,小应变为1%。组织粘附性测试采用新鲜猪皮的搭接剪切模型,具体是使用 20 mm×40 mm的矩形条状猪皮,在面积为20 mm×20 mm处涂抹200 μL水凝胶进行粘合,然后在万能材料试验机上测试,用公式(1)计算粘附强度。

(1)

$\mathrm{粘}\mathrm{附}\mathrm{强}\mathrm{度}\left(\mathit{\%}\right)={\mathit{F}}_{\mathit{m}\mathit{a}\mathit{x}}/\mathit{S}$

式中,F_max为剪切极限应力,N;S为猪皮上水凝胶粘附面积,m²。

通过触变性(小应变1%,大应变500%)测试水凝胶的自愈合能力。水凝胶的溶胀行为是将湿水凝胶(初始重量W_d)加入到30 mL PBS(pH 7.4)中,然后在特定的时间点将水凝胶取出,用滤纸除去表面多余水分后称重(W_t),由公式(2)计算质量的变化。

(2)

$\mathrm{质}\mathrm{量}\mathrm{变}\mathrm{化}\left(\mathit{\%}\right)=({\mathit{W}}_{\mathit{t}}/{\mathit{W}}_{\mathit{d}})\times 100\mathit{\%}$

1.6.2 Cur和锌离子释放

将1 mL的HACZ水凝胶加入30 mL PBS(pH=7.4)中,在37℃恒温水浴摇床以100 r/min的转速下摇动。在预定的时间间隔,每次取出2 mL上清液待测,然后补充2 mL PBS。通过UV-Vis测量上清液的吸光度(425 nm)。同时,锌离子的释放使用电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS,NexION 300×,PerkinElmer)测定。

1.6.3 抗氧化性能

通过对ABTS⁺自由基清除率验证水凝胶的抗氧化性能。避光条件下将ABTS与过硫酸钾在去离子水中混合,于室温反应12 h以制备ABTS⁺自由基,使用PBS稀释至适当浓度后,将梯度质量水凝胶样品(6、12、24、48、96 mg和192 mg)与3 mL稀释液充分混合。静置30 min后,通过UV-Vis测量不同样品在734 nm处的吸光度。将稀释的ABTS⁺自由基溶液定义为空白。由公式(3)计算ABTS⁺自由基的清除率。

(3)

$\mathit{A}\mathit{B}\mathit{T}{\mathit{S}}^{+}\mathrm{自}\mathrm{由}\mathrm{基}\mathrm{清}\mathrm{除}\mathrm{率}\left(\mathit{\%}\right)=\left[\right({\mathit{A}}_{0}-{\mathit{A}}_{\mathit{i}})/{\mathit{A}}_{0}]\times 100\mathit{\%}$

其中,A₀为空白对照溶液在734 nm处的吸光度,A_i为用不同样品(实验组)处理的所得溶液在734 nm处的吸光度。

1.6.4 抗菌性能

使用大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)评估水凝胶的抗菌活性。首先将凝胶前驱液进行紫外杀菌,并在24孔板中加入200 μL凝胶前驱液原位成胶,然后加入600 μL细菌悬浮液(10⁶ CFU/mL),于37℃培养箱中放置培养24 h。使用逐步稀释法将细菌悬浮液进行稀释,将100 μL细菌稀释液加入琼脂板中进行涂布,并在37℃恒温箱培养24 h。最后对菌落数计数以评估凝胶的抗菌能力。

1.6.5 生物相容性

血液相容性:将冻干水凝胶(10 mg)与3 mL 1%的猪红细胞悬浮液混合,并在37℃水浴摇床中振荡1 h,将除去水凝胶样品后的红细胞悬浮液以1 000 r/min离心30 min。使用UV-Vis测量上清液在 540 nm处的吸光度。PBS和0.1% Triton X-100分别用作阴性对照和阳性对照。水凝胶的溶血率由公式(4)计算。

(4)

$\mathrm{溶}\mathrm{血}\mathrm{率}\left(\mathit{\%}\right)=\left[\right({\mathit{A}}_{\mathit{S}}-{\mathit{A}}_{\mathit{P}})/({\mathit{A}}_{\mathit{W}}-{\mathit{A}}_{\mathit{P}}\left)\right]\times 100\mathit{\%}$

其中,A_S、A_P和A_W分别对应于水凝胶,阳性对照和阴性对照组的吸光度。

细胞相容性:使用水凝胶浸提液评估水凝胶的细胞毒性。首先将水凝胶浸入新鲜培养基中24 h,离心获得上清液作为水凝胶提取液。将NIH-3T3细胞接种到96孔板中,将培养基更换成水凝胶浸提液继续培养24 h。分别通过CCK-8(Invigentch)法和LIVE/DEAD^®试剂盒(Shanghai BestBio)评估细胞活力,并在荧光显微镜(FV1200,Olympus)下观察细胞的形态。

1.6.6 免疫调节性能

使用RAW264.7巨噬细胞评估凝胶的免疫调节作用。首先将RAW264.7巨噬细胞培养12 h,然后分为5组。空白对照组用PBS处理,剩余4组用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,100 ng/mL,Solarbio)处理24 h,然后分别加入PBS、透明质酸钠(25 μg/mL)、Cur@ZIF-8(0.5 μg/mL)和HACZ水凝胶(500 μg/mL),共培养48 h后,细胞用CD206染色,并用荧光显微镜(FV1200,Olympus)拍照。

2 结果与讨论

2.1 水凝胶的制备和表征

通过 ¹HNMR对HA-HDA和HA-CHO的结构进行表征。图1(a)所示,化学位移1.65~1.19处的多重峰为HDA基团中亚甲基质子峰,HDA的接枝度可通过与HA侧链上位移1.94处的甲基质子峰的积分对比,计算为34%。图1(b)所示,HA-CHO的谱图中在位移5.00附近出现了多重峰,是醛基与邻位羟基发生分子内加成形成半缩醛的质子峰,从而证明了HA-CHO的成功制备;经过叔丁基卡巴肼法测定了醛基含量为35%。

图2显示了负载Cur前后ZIF-8的形貌,均呈现出均匀、典型的十二面体形貌,且Cur@ZIF-8的粒径比纯ZIF-8略大,证明了Cur的成功负载。通过比较制备Cur@ZIF-8反应前后上清液中UV-Vis吸光度的变化,可以计算出Cur的负载量为0.071 mg Cur/mg Cur@ZIF-8。

将HA-HDA、HA-CHO和Cur@ZIF-8共混后静置,即可以通过氨基和醛基之间的Schiff碱交联得到目标HACZ水凝胶。使用HA-HDA和HA-CHO共混形成的HA水凝胶作为对照组凝胶。如图3所示,所制备的两种水凝胶均显示出三维网络结构,且孔壁薄而连续,孔隙之间高度连通,有利于细胞的浸润和物质交换。

2.2 水凝胶的流变学和组织粘附性测试

由于伤口愈合过程是一个复杂且动态的生理过程,因此水凝胶需要具备多种优良特性。其中,良好的机械性能是不可或缺的,它能保证水凝胶在与伤口接触及后续的使用过程中,维持自身的形状与结构稳定性,且不轻易发生破损、变形等情况,从而持续有效地覆盖和保护伤口。为了评估水凝胶的机械性能,首先测试了水凝胶的流变性能。如图4(a)所示,两组水凝胶的储能模量G'的数值在0.1~100 rad/s的角频率范围内都超过了损耗模量G″的数值,这表明2组水凝胶均处于凝胶状态,展现出良好的弹性特性。另外,2组水凝胶的G'值基本相当,表明了Cur@ZIF-8纳米颗粒的添加没有影响凝胶网络的形成和稳定性。使用连续交替应变扫描进一步评估水凝胶的自修复特性,如图4(b)、(c)所示。在1%的低应变下,水凝胶的G'值显著高于G″值,且与频率扫描数值基本吻合,表明水凝胶处于凝胶状态。当应变增加到500%时,G'值下降到G″值以下,表明发生了凝胶到溶胶的相转变。而当应变恢复到1%时,水凝胶的G'和G″值迅速恢复至初试状态,展现了水凝胶优异的自修复性能。另外,水凝胶出色的黏附性能也极为关键,它能够确保水凝胶紧密贴合在伤口表面,不易脱落,使得伤口始终处于水凝胶的有效作用范围内,进而促进伤口的良好愈合。如图4(d)所示,两组水凝胶都展现出良好的组织粘附性。总之,所制备的水凝胶展现出良好的结构稳定性,为其后续作为伤口敷料的应用奠定了力学基础。

2.3 水凝胶的溶胀、活性物质释放和抗氧化性能测试

良好的降解性能是水凝胶作为伤口敷料另一不可或缺的特性。随着伤口的逐渐愈合,水凝胶需要能够在合适的时间内逐步降解,释放出对伤口愈合有益的成分,从而为伤口创造一个安全、有利的愈合环境,更好地促进伤口愈合。如图5(a)所示,将水凝胶浸泡到PBS中后,两组水凝胶展现出一致的溶胀降解特性。在初期,水凝胶都发生了溶胀,然后质量逐渐下降,并在第6天时趋于完全降解。该实验结果表明所制备水凝胶具备一定的组织液吸收能力,有望为伤口的愈合提供有利环境。另外,作为两种活性组分,Cur和Zn²⁺可以持续从HACZ水凝胶中释放出来,二者展现出相似的释放曲线[图5(b)、(c)],并在第48 h以后趋于稳定,这为水凝胶在伤口处发挥抗氧化和抗菌性能提供了保证。使用ABTS⁺自由基清除实验进一步验证了水凝胶的抗氧化性能,如图5(d)所示,HACZ水凝胶对ABTS⁺自由基的清除率展现出凝胶的浓度依赖性,在32 mg/mL的浓度时可以清除超过95%的自由基,展现出HACZ优异的抗氧化性能。同时,与HA水凝胶的抗氧化性能相比,进一步证明了HACZ水凝胶的优异抗氧化性能得益于Cur的添加。

2.4 抗菌性能和生物相容性

在伤口恢复的关键调控期,细菌感染是影响愈合速率的决定性因素之一,因此伤口敷料的抗菌性能显得尤为重要。因此,使用革兰氏阴性代表菌大肠杆菌(E.coli)对水凝胶的体外抗菌性能进行了评估。如图6(a)、(b)所示,与空白组和HA水凝胶组相比,HACZ水凝胶杀死了超过95%的细菌,证明了HACZ水凝胶具有优异的抗菌性能。另外,优异的生物相容性是水凝胶作为伤口敷料应用的核心前提。首先使用NIH 3T3细胞对水凝胶的细胞毒性进行了测试,结果表明所有水凝胶均表现出良好的细胞活力,活/死染色实验结果显示为绿色和梭形细胞[图6(c)],且细胞存活率与空白组相当[图6(d)]。还采用阴阳双对照模型(分别以PBS和0.1% Triton X-100作为阴性和阳性对照)来探索和分析了水凝胶的血液相容性。如图6(e)所示,两组水凝胶都展现出较低的溶血率(<3.0%)。总之,所制备水凝胶表现出优异的细胞相容性和血液相容性,为其临床应用前景奠定了坚实的基础。

2.5 免疫调节性能

从免疫调节的角度来看,具有巨噬细胞表型调节能力的伤口敷料在组织修复中发挥着举足轻重的作用。选择CD206作为M2表型巨噬细胞的标记物,从图7中可以看出,透明质酸钠组和HACZ水凝胶组都显著增强了CD206的表达水平,表明了透明质酸钠介导了HACZ水凝胶良好的巨噬细胞极化调节性能。

3 结论

本研究成功制备了一种具有免疫调节功能的透明质酸纳米复合水凝胶(HACZ),该凝胶以己二胺接枝透明质酸和醛基化透明质酸为骨架,通过Schiff碱交联原位形成,并负载了Cur@ZIF-8纳米颗粒。系统表征和性能评价表明。

(1)水凝胶具有三维多孔网络结构,孔隙连通性好,有利于细胞迁移和物质交换。

(2)流变学测试显示水凝胶具有良好的弹性和自修复性能,组织粘附强度满足伤口敷料要求。

(3)HACZ水凝胶能够持续释放Cur和Zn²⁺,并表现出浓度依赖性的ABTS⁺自由基清除能力(32 mg/mL时清除率>95%)。

(4)对大肠杆菌的抗菌率超过95%,溶血率低于3%,细胞存活率与空白组相当,表明其优异的抗菌性能和生物相容性。

(5)体外巨噬细胞极化实验证实,水凝胶显著增强CD206(M2表型)的表达,展现出良好的免疫调节性能。

综上所述,该纳米复合水凝胶集抗菌、抗氧化、免疫调节及良好生物相容性于一体,为皮肤伤口修复提供了一种有前景的新型功能敷料。

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