现代化工

现代化工 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (7) : 240-244. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.07.041

分析测试

玉米根系分泌物中七种有机酸的LC-MS/MS快速定量分析方法研究

李贺 ¹^,² ,
卢兵 ¹^,² ,
谢旭 ¹^,²^,^* ,
赵文志 ¹^,² ,
谢潇 ³

作者信息 +

Study on rapid quantitative analysis method of seven organic acids in maize root exudates by LC-MS/MS

LI He ¹^,² ,
LU Bing ¹^,² ,
XIE Xu ¹^,²^,^* ,
ZHAO Wen-zhi ¹^,² ,
XIE Xiao ³

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Received		Published
2025-09-10		2026-07-20
Issue Date	Revised Date
2026-07-10	2025-09-10

PDF (1622K)

摘要

玉米根系分泌的有机酸在土壤养分活化、根际微环境调节及植物生长发育中具有重要作用。传统检测有机酸的方法(如HPLC、GC等)存在分离效率低、前处理复杂或灵敏度不足等问题,限制了有机酸的高效分析。本研究建立了基于LC-MS/MS的快速定量分析方法,采用HR-ODS色谱柱(150 mm×3.0 mm,3 μm),以0.2%甲酸水-乙腈(pH 6.5)为流动相(0.5 mL/min),优化了质谱参数,可在5 min内完成7种目标有机酸(L-苹果酸、柠檬酸、反式-乌头酸、DL-酒石酸、L-乳酸、丙二酸、丁二酸)的分离测定。方法检出限为0.08~29.12 μg/L,加标回收率84.10%~130.16%。应用于实际样品,成功检出4种有机酸(L-苹果酸4.169±0.21 μg/L、柠檬酸42.571±3.03 μg/L、DL-酒石酸16.274±1.12 μg/L、丙二酸797.391±15.32 μg/L)。该方法高效、灵敏、准确,为研究玉米根系分泌物组成及其生态功能提供了可靠手段。

Abstract

Organic acids secreted by maize roots play a crucial role in soil nutrient activation,rhizosphere microenvironment regulation,and plant growth and development.Traditional methods for detecting organic acids (e.g.,HPLC,GC) suffer from limitations such as low separation efficiency,complex pretreatment,or insufficient sensitivity,which hinder efficient analysis.This study established a rapid quantitative analysis method based on LC-MS/MS,utilizing an HR-ODS chromatographic column (150 mm×3.0 mm,3 μm) and a mobile phase of 0.2% formic acid in water-acetonitrile (pH 6.5) at a flow rate of 0.5 mL/min.Mass spectrometry parameters were optimized to achieve the separation and quantification of seven target organic acids (L-malic acid,citric acid,trans-aconitic acid,DL-tartaric acid,L-lactic acid,malonic acid,and succinic acid) within 5 minutes.The method demonstrated a detection limit of 0.08-29.12 μg/L and a spike recovery rate of 84.10%-130.16%.When applied to real samples,four organic acids were successfully detected:L-malic acid (4.169±0.21 μg/L),citric acid (42.571±3.03 μg/L),DL-tartaric acid (16.274±1.12 μg/L),malonic acid (797.391±15.32 μg/L).This method is efficient,sensitive,and accurate,providing a reliable tool for studying the composition and ecological functions of maize root exudates.

Graphical abstract

关键词

高效液相色谱质谱 / 有机酸 / 玉米 / 根系分泌物

Key words

high performance liquid chromatography-mass spectrometry / organic acids / maize / root exudates

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李贺,卢兵,谢旭,赵文志,谢潇. 玉米根系分泌物中七种有机酸的LC-MS/MS快速定量分析方法研究[J]. 现代化工, 2026, 46(7): 240-244 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.07.041

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有机酸通常指羧酸,其酸性源于羧基(—COOH)^[1]。植物组织(如叶、根、果实)富含天然有机酸,对植物生长具有重要生理作用,包括促进养分释放吸收、维持土壤结构、促进微生物活动及减轻重金属毒害^[2]。玉米在农业和工业中的地位十分重要^[3],其根系分泌多种有机酸(如苹果酸、柠檬酸、乌头酸、酒石酸、乳酸、丙二酸、丁二酸)^[4]。这些有机酸通过酸化、螯合、离子交换和还原等作用,活化根际难溶性养分,提高土壤养分有效性,促进植物吸收和生长^[5]。同时,它们可被植物再吸收利用,参与营养元素循环和能量流动^[6]。综上所述,玉米根系分泌的有机酸种类多样,在土壤养分活化和改善根际环境中发挥着重要作用^[7]。

目前植物根系分泌有机酸检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、离子色谱法(IC)和毛细管电泳法(CE)等。由于土壤中的有机酸多为非挥发性或低挥发性物质,因此在使用GC法进行检测时需要进行衍生化反应以提高其挥发性,这增加了GC法的复杂性和成本^[8]。IC法对目标物的定性主要依赖保留时间,容易受到共存离子的干扰,因此在复杂基质如土壤中的应用受到限制^[9]。CE法灵敏度和精密度相对较差,对于痕量有机酸的检测可能存在困难^[10]。HPLC法能够快速分析样本中的主要有机酸类成分,同时能测定多种有机酸,但分离效果受流动相、色谱柱等因素的影响,导致HPLC在一些有机酸的检测中受到限制^[11]。

高效液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)是将液相色谱与质谱技术相结合,首先通过液相色谱分离化合物,然后利用质谱技术对分离出的化合物进行质荷比测定,从而得到化合物的分子质量、结构等信息。目前LC-MS/MS法广泛地应用于生物样品分析、药物代谢研究以及新化合物的发现等领域^[12]。由于能够在不破坏样品的情况下提供更为精确和详细的结构信息,因此在植物有机酸检测方面显现出优势。本研究选择的7种有机酸(L-苹果酸、柠檬酸、反式-乌头酸、DL-酒石酸、L-乳酸、丙二酸、丁二酸)覆盖玉米根系分泌的主要功能组分,同时其理化性质差异(如极性、分子质量)还可系统性验证LC-MS/MS方法的普适性。以此探讨LC-MSMS法对玉米根系分泌物中的有机酸检测方法的建立和可行性,弥补传统技术对挥发性与非挥发性有机酸同步检测的不足,为玉米根系分泌物中有机酸含量的测定提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

实验设备为LCMS-8050高效液相色谱质谱联用系统(泵系统LC-40B×3、进样器SIL-40B×3、柱温箱CTO-40S,日本岛津公司);优普UPR-60L超纯水器(四川优普超纯科技有限公司);LRH-100CB恒温培养箱(上海蓝豹试验设备有限公司);R-300EL旋转蒸发仪(日本步琦公司)。L-苹果酸(≥98.0%)、柠檬酸(≥99.8%)、反式-乌头酸(≥98.0%)、DL-酒石酸(≥99.5%)、L-乳酸(≥98%)、丙二酸(≥99.0%)、丁二酸(≥99.5%)均为标准品(国药集团化学试剂有限公司),甲酸(色谱纯,美国赛默飞公司)、乙腈(色谱纯,德国默克公司)

1.2 实验条件

色谱、质谱条件:采用HR-ODS色谱柱(150 mm×3.0 mm,3 μm,SHIMADZU),以0.2%甲酸-水和0.2%甲酸-乙腈(pH=6.5)作为流动相,流速0.50 mL/min,柱温35℃,雾化器流量3 L/min,加热气体流量15 L/min,接口温度350℃,脱溶剂温度602℃,DL温度250℃,加热模块温度500℃,干燥气流量 5 L/min。流动相泵梯度见表1。

1.3 玉米根系分泌物收集

根系分泌物收集采用水培法^[13],选取生长情况一致的玉米幼苗,用去离子水洗净,放入含有1.5 L体积分数25% Hoagland营养液^[14]的塑料盆中,置于人工培养箱中培养15 d,每天加入去离子水保持培养液体积不变,每3 d更换一次营养液。培养条件为:光周期10 h,温度24℃,相对湿度70%,光照强度6 500 Lx。第15 d光照2 h后将玉米苗取出,先用蒸馏水冲洗根部3次,在新制备的超纯水中加入3滴0.05%的百里酚水溶液^[15],浸泡植物根部 5 min,再用超纯水清洗根部3次。将玉米苗放入 500 mL浓度0.5 mmol/L的CaCl₂溶液中,每份加入3滴0.05%百里酚水溶液,放回培养箱中光照收集 5 h。用0.45 μm的滤膜抽滤收集液后经旋转蒸发(40℃,90 r/min)浓缩,再用氮气吹干,最后定容至 2 mL,放置于冰箱中冷藏备用。

1.4 有机酸标准溶液配制

称取L-苹果酸、柠檬酸、反式-乌头酸、DL-酒石酸、L-乳酸、丙二酸、丁二酸各0.500 0 g,分别用超纯水溶解并定容至100 mL放置于冰箱中保存,检测时用现配的流动相稀释成所需浓度。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

2.1.1 色谱柱的选择

色谱柱主要根据其固定相的类型来分类,常见的有C₁₈、C₈、苯基柱等。C₁₈柱因良好的疏水性,广泛应用于非极性和弱极性化合物的分离^[16]。考虑到玉米根系分泌物中的有机酸多为弱酸性或中性,C₁₈柱能够提供较好的保留和分离效果。此外,C₁₈柱的耐受性较好,适合于多种溶剂系统。

2.1.2 流动相的组成

在高效液相色谱质谱技术中,流动相的选择对于分离效果和分析灵敏度具有决定性影响。流动相不仅需要与样品中的目标化合物有良好的溶解性,还应保证色谱柱的稳定性和寿命,同时考虑到质谱检测的需求,本研究分别选择了甲醇、乙腈、水、磷酸盐溶液作为流动相^[17-18],以比较几种流动相对混合有机酸的分离效果。在流动相中添加适量的甲酸调节流动相的pH有助于使小分子有机酸保持分子形式,使有机酸在色谱柱上的保留行为更规则,从而改善峰形,提高峰的对称性和尖锐度,有利于准确的定量和定性分析。实验结果表明采用0.2%甲酸-水和0.2%甲酸-乙腈能够较好地分离7种目标有机酸,且峰形良好(图1),故选择0.2%甲酸-水和0.2%甲酸-乙腈为流动相。

2.1.3 流速选择

流速是影响分离效能和分析时长的关键因素,其选择需综合考虑色谱柱特性、样品基质及目标化合物性质。本研究为优化玉米根系分泌物有机酸的测定,系统考察了不同流速(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min)的影响。结果表明,流速为0.5 mL/min时,多数目标有机酸呈现最佳色谱响应与分离度,且分析时长适中。

为验证0.5 mL/min流速的适用性,开展了重复性实验。在同一样品、相同条件下进行多次分析,计算峰面积的相对标准偏差(RSD)。结果显示,RSD值均低于5%,表明在该流速下,方法具有良好的重复性。同时,考察了流速对质谱信号强度的影响。结果表明,在0.5 mL/min的流速下,质谱信号最为稳定,灵敏度最高。

2.2 质谱条件

质谱条件的优化对于提高分析灵敏度、准确性和重现性至关重要。本研究针对玉米根系分泌物有机酸含量测定,通过系统调整质谱参数(表2),以达到最佳的分离和检测效果(图2)。优化过程主要聚焦于离子源参数、碰撞能量(CE)以及数据采集模式。采用单针自动进样分析目标化合物标准溶液(100 μg/L),以优化质谱参数;选择响应值最高且干扰最少的2个碎片离子为定性和定量离子,进行碰撞能量的优化。通过对这些参数的调控,提升目标化合物的离子化效率和信号强度,从而实现对有机酸含量的精确测定。经过优化后的质谱条件相比优化前有明显改善,不仅提高了玉米根系分泌物中有机酸含量测定的灵敏度和准确性,而且增强了方法的稳定性和重现性。

2.3 方法科学评价

2.3.1 标准曲线与检出限

根据前述步骤和条件,将系列混合标准溶液依次等体积进样,以峰面积(y)对质量浓度(x,mg/L)进行线性回归,对标准溶液进行稀释,取S/N=3时组分的质量浓度为检出限,7种有机酸的线性回归方程、线性相关系数(R²)、检出限和定量限见表3。

通过表3可以看出,不同有机酸的检定下限和检出限存在差异,这主要与各有机酸的物理化学性质有关^[19]。例如,柠檬酸由于分子质量较大,因此检定下限和检出限相对较高^[20]。

2.3.2 回收率和精密度

为检验该方法的准确性,分别进行了回收率和精密度试验。在优化的条件下对7种目标有机酸进行加标分析。在优化后的色谱-质谱条件下测定并计算各有机酸的加标回收率及其相对标准偏差(RSD),平行测定7次。如表4所示,7种有机酸的加标回收率范围在84.10%~130.16%,精密度范围在0.95%~16.20%,表现出良好的准确度和精密度。该方法的线性范围及分析结果的精密度和回收率都能满足植物根系分泌物中有机酸的定性和定量分析的要求。

2.4 实际根系分泌物的测定

采用优化后的LC-MS/MS方法和传统HPLC方法对玉米根系分泌物中的有机酸成分进行同步检测。通过对比LC-MS/MS法和HPLC法发现,LC-MS/MS能够成功检出4种有机酸,而HPLC仅检出3种(表5)。2种方法对同一样品多次测定的结果差异较小,但LC-MS/MS的重复性(0.95%~16.20%)略优于HPLC(5.13%~20.12%)。LC-MS/MS的加标回收率(84.10%~130.16%)优于HPLC(77.36%~135.30%),尤其在低浓度有机酸(如L-苹果酸)检测中表现更稳定,LC-MS/MS通过多反应监测(MRM)模式有效避免共洗脱干扰,而HPLC依赖保留时间定性,易受复杂基质影响(如DL-酒石酸与杂质峰重叠)。上述差异可能与玉米生长环境、土壤类型以及采样时间等因素有关^[21],但LC-MS/MS方法在灵敏度、选择性和稳定性上的优势使其更适用于复杂基质中痕量有机酸的同步检测。

3 结论

本研究应用高效液相色谱质谱技术,通过对色谱、质谱条件的优化,建立了准确、灵敏的分析方法。对玉米根系分泌物实际样品中的有机酸含量进行了测定,结果表明,该方法能够有效分离并检测到多种有机酸,且具有良好的线性范围、回收率以及较低的检出限,满足实际样品分析的要求,为深入解析植物根系分泌物的组成与功能,促进植物与土壤环境的和谐发展提供科学依据。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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