现代化工

现代化工 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (7) : 140-145. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.07.025

科研与开发

解糖假苍白杆菌还原六价铬的特性及条件优化

王利沙 ¹ ,
贺治国 ²^,^* ,
赵洪侠 ¹ ,
孙杰 ¹ ,
仲诚 ¹ ,
张艳玲 ¹

作者信息 +

Characteristics and condition optimization of hexavalent chromium reduction by pseudochrobactrum saccharolyticum

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Received		Published
2025-09-17		2026-07-20
Issue Date	Revised Date
2026-07-10	2025-09-17

PDF (2495K)

摘要

从湖南省长沙市废弃铬盐厂的土壤中成功分离出一株具有高Cr(Ⅵ)抗性和去除率的菌株W1。通过16S rDNA基因序列和DNA G+C mol%含量测定,该菌株被鉴定为假苍白杆菌属(Pseudochrobactrum)革兰氏阴性杆菌。研究探讨了不同初始温度(25~40℃)、pH(7.5~11.0)和Cr(Ⅵ)(0~3 000 mg/L)浓度下对菌株生长及Cr(Ⅵ)去除效果的影响,并分析了胞外多聚物(EPS)与去除效率的关联。结果表明,从铬渣中分离出的菌株W1的最适生长及Cr(Ⅵ)去除条件为温度35℃、pH=9.5;其对Cr(Ⅵ)的最低抑菌浓度约为2 500 mg/L,在1 000 mg/L Cr(Ⅵ)处理下56 h内去除率高达71.54%,且此时EPS产量最高(357.14 mg/g),其中蛋白质为主要组分,与Cr(Ⅵ)去除呈正相关。该菌株在高浓度Cr(Ⅵ)污染场地的微生物修复中具有良好应用前景。

Abstract

A strain W1 with high Cr(Ⅵ) resistance and removal rate was successfully isolated from chromium-contaminated soil from an abandoned chromium salt factory in Changsha,Hunan Province.Through 16S rDNA gene sequence and DNA G+C mol% content determination,the strain was identified as a Gram-negative bacterium of the genus Pseudochrobactrum.The study investigated the effects of different initial temperatures (25-40℃),pH (7.5-11.0),and Cr(Ⅵ) concentrations (0-3 000 mg/L) on bacterial growth and Cr(Ⅵ) removal efficiency,and analyzed the correlation between extracellular polymeric substances (EPS) and removal efficiency.The results showed that the optimal growth and Cr(Ⅵ) removal conditions for strain W1 isolated from chromium slag were temperature of 35℃ and pH 9.5;Its minimum inhibitory concentration for Cr(Ⅵ) is about 2 500 mg/L,and the removal rate reaches 71.54% within 56 hours under 1 000 mg/L Cr(Ⅵ) treatment.At this time,EPS production is the highest (357.14 mg/g),with protein as the main component,positively correlated with Cr(Ⅵ) removal.This strain has good application prospects in microbial remediation of high concentration Cr(Ⅵ) contaminated sites.

Graphical abstract

关键词

六价铬[Cr(Ⅵ)] / 假苍白杆菌 / 分离 / 鉴定 / 抗性

Key words

hexavalent chromium[Cr(Ⅵ)] / pseudochrobactrum / isolation / identification / resistance

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王利沙,贺治国,赵洪侠,孙杰,仲诚,张艳玲. 解糖假苍白杆菌还原六价铬的特性及条件优化[J]. 现代化工, 2026, 46(7): 140-145 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.07.025

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在重金属污染物中,六价铬[Cr(Ⅵ)]因其高毒性被世界各国列为优先控制的环境污染防治对象。自工业革命以来,铬(Cr)被广泛应用于皮革鞣制、纺织染色、电镀、制药、钢铁冶炼等行业^[1-3],导致其在环境中大量累积。铬在水和土壤中主要以 Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)两种氧化态存在,其中Cr(Ⅵ)的毒性约为Cr(Ⅲ)的100倍^[4],且具有极强的水溶性、高毒性、强氧化性、致畸性和致癌性等,严重危害了环境安全和人类健康^[5-6]。因此,Cr(Ⅵ)污染土壤的治理已然成为当前亟需解决的环境问题。

国内外传统的Cr(Ⅵ)污染修复技术(如离子交换法、生物吸附法、电化学修复法等)普遍存在成本高昂、操作复杂、易产生大量的有毒物质导致二次污染等局限,难以实现大规模推广应用^[3,7]。1997年,Romanenko等^[8]首次报道脱色杆菌可在厌氧条件下将Cr(Ⅵ)还原为低毒性的Cr(Ⅲ),为生物修复技术提供了新思路。此后,众多学者也开始研究 Cr(Ⅵ)还原菌,依次筛选出芽孢杆菌^[9-10]、土壤杆菌属^[11]、假单胞菌^[12]等,为Cr(Ⅵ)污染生物修复技术的实践应用提供了丰富的菌种资源,也证实微生物修复具有高效、低成本、环境友好等优势^[13-14]。

微生物胞外多聚物(EPS)作为细菌表面的重要分泌物,在重金属吸附和胁迫抗性中发挥着关键作用^[15]。Kiran等^[16]的研究表明,EPS可通过表面官能团与重金属结合,增强菌株对铬的耐受性和去除能力。然而,针对关停铬盐厂的铬渣堆场等重度污染场地,高铬耐受性、高去除率菌株的筛选及EPS作用机制的研究仍较为匮乏。基于此,本研究从湖南省长沙市废弃铬盐厂的污染土样中,选取了贺治国老师团队前期筛选出的5株抗铬细菌,聚焦其中一株(菌株W1)进一步开展优化培养工作。通过16S rDNA测序和生理生化特性分析明确其分类地位,系统探究温度、pH、Cr(Ⅵ)浓度对其生长及 Cr(Ⅵ)去除效果的影响,并揭示EPS在Cr(Ⅵ)去除中的作用。研究旨在为高浓度Cr(Ⅵ)污染场地的微生物修复提供优质菌种资源和理论依据,推动低成本高效修复技术的开发与应用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品采集

实验研究土样来自于湖南省长沙市某铬盐厂的铬渣污染土壤。

1.1.2 LB培养基

利用改良的LB培养基,培养基成分为:蛋白胨10.0 g/L,氯化钠5.0 g/L,磷酸氢二钾0.05 g/L,七水硫酸镁0.2 g/L,酵母提取物5.0 g/L,用10 mol/L氢氧化钠调节pH为9.0左右,高温高压灭菌 20 min,冷却后备用,于160~180 r/min、30℃条件下进行振荡培养,其中菌株的分离筛选和纯培养采用LB固体培养基(上述成分中加入琼脂12 g/L)。液体和固体培养基中均添加350 mg/L的Cr(Ⅵ)作为筛选菌株的条件。

1.1.3 筛选培养基

在改良的LB培养基的基础上,加入重铬酸钾(K₂Cr₂O₇),配制成Cr(Ⅵ)的质量浓度分别为375、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的储备液。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的分子生物学鉴定

(1)16S rDNA测序

取一定量的培养基,离心后收集菌体,采用北京天根细菌DNA提取试剂盒进行基因组总DNA的提取,其16S rDNA基因扩增采用通用引物1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3')和27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'),聚合酶链式反应(PCR)产物送至上海生工生物公司进行测序,测序所得序列在NCBI数据库中进行相似性分析,采用MEGA 3.1和Clustal W软件进行系统发育树的构建,找到相似度最高的序列。

(2)DNA G+C mol%含量测定

细菌DNA中G+C mol%含量的不同是一个重要的遗传特性,其测定也已成为细菌分类和菌种鉴定的重要依据之一^[17]。本研究中采用灵敏度和准确度高的高效液相色谱法,主要参考潘星时等^[18]方法进行提取与测定。

1.2.2 菌株的生长曲线

取对数生长期的菌液,接种浓度为5×10⁷ cells/mL,将其加入到LB培养基中[含350 mg/L Cr(Ⅵ),用K₂Cr₂O₇溶液作为Cr(Ⅵ)源],设置温度为35℃,调pH为9.5,进行振荡培养,定时取样,用显微镜计数并确定溶液中细菌的数量,所有实验均重复3次。

1.2.3 菌株的耐铬能力

将菌株进行驯化培养,提高对Cr(Ⅵ)的耐受性。在最佳培养条件下,细菌的接种浓度为5×10⁷ cells/mL,分别接种到含有Cr(Ⅵ):0、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的高温灭菌的LB培养基中振荡培养,间隔不同时间取样,用显微镜计数并确定溶液中细菌的数量,所有实验均重复3次。

1.2.4 菌株除Cr(Ⅵ)能力的影响因素

(1)温度对菌株W1除铬能力的影响

取对数生长期的菌液加入到LB培养基中[含 1 000 mg/L Cr(Ⅵ),细菌的接种浓度为5×10⁷ cells/mL,K₂Cr₂O₇溶液作为Cr(Ⅵ)源],分别设置温度为25、30、35℃和40℃,调pH为9.5左右,160~180 r/min振荡培养50 h后进行离心,收集上清液,采用分光光度法测定菌株对Cr(Ⅵ)去除率。所有实验均重复3次。

(2)pH对菌株W1除铬能力的影响

取对数生长期的菌液加入到LB培养基中[含 1 000 mg/L Cr(Ⅵ),细菌的接种浓度为5×10⁷ cells/mL,K₂Cr₂O₇溶液作为Cr(Ⅵ)源],用10 mol/L氢氧化钠分别调节溶液的初始pH为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0,调节温度为35℃,160~180 r/min振荡培养50 h后进行离心,收集上清液,采用分光光度法测量菌株对Cr(Ⅵ)去除率。所有实验均重复3次。

(3)Cr(Ⅵ)浓度对菌株W1除铬能力的影响

将菌株W1接种于分别含有Cr(Ⅵ):0、500、1 000、1 500、2 000、2 500 mg/L的100 mL液体LB培养基中,设置温度35℃、pH为9.5、细菌的接种浓度为5×10⁷ cells/mL,在160~180 r/min下培养50 h后进行离心,收集上清液,采用分光光度法测量菌株对Cr(Ⅵ)去除率。所有实验均重复3次。

1.2.5 Cr(Ⅵ)去除率的检测方法

采用分光光度法,以二苯碳酰二肼(DAPI)作为显色剂^[19],取上清液50 μL,在540 nm下测定其吸光度值并计算出上清液中剩余的Cr(Ⅵ)浓度,用初始Cr(Ⅵ)浓度与上清液中Cr(Ⅵ)浓度的差值,即为菌株对Cr(Ⅵ)去除率。

1.2.6 EPS的提取与测定

将菌株W1接种于分别含有Cr(Ⅵ):0、500、1 000、1 500、2 000、2 500 mg/L的100 mL液体LB培养基中,分别设置生长的最适宜温度35℃和pH=9.5,160~180 r/min下培养40 h,10 000 r/min离心15 min收集菌液,且采用乙二胺四乙酸(EDTA)提取法^[20]从菌液中收集胞外多聚物(EPS)并测定其含量。其中菌液进行真空冷冻干燥至恒重,测得菌体的干重。

EPS产量用蛋白质、多糖、核酸之和表示,单位为mg/g(以VVS计),3组分测定方法分别为考马斯亮蓝法、蒽酮比色法和二苯胺法,所有实验均重复3次,实验结果取3次实验结果的平均值。

2 结果与讨论

2.1 菌株的分子生物学鉴定

2.1.1 16S rDNA基因测序和系统发育分析

测序结果显示,该菌株的基因序列长度为 1 388 bp,将其序列进行同源性和相似性对比分析并绘制系统发育树,结果如图1所示。由图1可知,菌株W1(FJ983141)与解糖假苍白杆菌(P.saccharolyticum)同属一个分支,且与P.saccharolyticum strain GIMCC 1.001 5同源性最高。同时,高压液相色谱测定结果表明,该菌株的DNA G+C mol%含量为52.85,与已知的解糖假苍白杆菌(P.asaccharolyticum CCUG 46016T)DNA G+C mol%含量(50.9)相近。综合以上分析,进一步判定菌株W1与假苍白杆菌属(Pseudochrobactrum)的遗传距离最近,因此初步将菌株W1鉴定为假苍白杆菌属(Pseudochrobactrum)的一种。

2.1.2 菌株的生长曲线

在特定环境条件下,菌株生长繁殖的基本规律可通过其生长曲线体现^[11]。本课题组的前期研究已明确,筛选出的菌株W1最适生长繁殖条件为:温度为35℃,pH为9.5,经过铬驯化,在1 000 mg/L Cr(Ⅵ)处理下,菌株W1的生长曲线和铬的去除效果如图2所示。由图2可知,菌株W1在铬存在的条件下生长状况良好,且在56 h内对Cr(Ⅵ)的去除率高达70%。

由图2(a)可以看出,菌株W1生长态势良好,其迟缓期时间较长,7 h后进入生长对数期,在7~51 h内均处于对数生长期。随着培养时间延长,菌株于51 h后逐渐进入稳定期,生长繁殖速度逐步减缓,78 h后则进入衰退期。菌株在51 h后进入稳定期,可能是铬持续被菌株摄取、转化的同时,培养基内营养物质不断消耗且代谢废物逐渐积累,多重因素共同作用导致生长速度受影响^[21]。结果表明在改良LB培养基中,菌株的适宜培养时间约为 51 h。

由图2(b)可以看出,随着时间的延长,在56 h内上清液中Cr(Ⅵ)的质量浓度从1 000 mg/L下降到了284.6 mg/L,其去除率高达71.54%。已有研究表明,经铬驯化的菌株可通过自身酶促反应,将毒性较强的Cr(Ⅵ)还原为毒性较低的水溶性有机 Cr(Ⅲ),而这些还原产物无法渗透进入细胞内部,从而有效降低环境中Cr(Ⅵ)的浓度^[10,22]。菌株W1经铬驯化后能在含Cr(Ⅵ)环境中生长良好,很可能就是通过高效的生物还原作用实现对Cr(Ⅵ)的去除;同时,该菌株较长的对数生长期(7~51 h)为持续合成还原酶提供了充足的菌体基础和代谢保障,这也是其能维持高去除效率的重要原因。

2.1.3 菌株耐铬特性

驯化培养后,W1对Cr(Ⅵ)的耐受程度从1 225 mg/L升高到了2 500 mg/L,得到对Cr(Ⅵ)具有高抗性的菌株,结果如图3所示。由图3可见,当培养基中不含Cr(Ⅵ)时,菌株也能生长;在Cr(Ⅵ)浓度为0~1 500 mg/L的培养过程中,Cr(Ⅵ)浓度越高,越有利于菌株的生长;但在 Cr(Ⅵ)浓度为1 500~3 000 mg/L的培养过程中,菌株的生长呈下降趋势,到3 000 mg/L时菌株基本不生长,这说明高浓度的Cr(Ⅵ)抑制了菌株的生长繁殖,加剧了对其的毒害作用^[11]。因此,菌株W1在Cr(Ⅵ)浓度为 1 500 mg/L时生长达到顶峰,且 Cr(Ⅵ)对W1的最低抑菌浓度约为2 500 mg/L。

2.2 影响菌株W1去除Cr(Ⅵ)的能力因素分析

2.2.1 温度对菌株W1去除Cr(Ⅵ)能力的影响

温度对菌株W1去除Cr(Ⅵ)能力的影响如图4所示。由图4可知,在温度25~35℃时,菌株W1对Cr(Ⅵ)去除率随着温度的升高逐渐增加,在35℃时,去除率高达69.89%;而温度为40℃时,Cr(Ⅵ)的去除效果最差。结果表明菌株最适宜温度为35℃,此时对铬的去除率最高。

温度是微生物修复污染过程中的重要因素,对菌株的生长繁殖状况、生物膜上相关蛋白酶的催化活性等都有较大影响^[9,12]。当温度较高时,细菌的生长会受到明显抑制,菌株细胞内的蛋白质发生变性,细胞膜结构也会随之改变;当温度较低时,细菌菌株细胞膜的流动性会减弱,这会阻碍细胞的物质运输功能,使得营养物质难以快速进入细胞内部,不利于其生长繁殖,进而影响其对铬的去除^[23]。但在一定范围内,适当升高温度,有利于提升菌株对重金属离子的去除效果。

2.2.2 pH对菌株W1去除效果的影响

pH对菌株W1去除Cr(Ⅵ)能力的影响如图5所示。由图5可知,菌株W1对Cr(Ⅵ)的去除率随着培养基中pH的增加出现先升高后下降的趋势。在初始pH为7.5时,菌株对Cr(Ⅵ)的去除效果不理想,去除率仅为1.8%;在pH=7.5~9.5时,随着pH的升高,去除率明显升高。这表明菌株生长的最适pH为9.5,在此条件下其去除率最高,高达70.5%。故菌株在pH=9.0~10.0为最佳除Cr(Ⅵ)的酸碱度。

溶液pH对菌株去除Cr(Ⅵ)影响较大,pH过高或者过低都会改变细胞膜的通透性、物质的溶解性或者是膜结构的稳定性等,影响菌株对营养物质的吸收利用,不利于菌株的生长繁殖^[23-25],进而影响对Cr(Ⅵ)的去除效果。但在一定范围内,适当升高pH有利于菌株对重金属离子的去除,这是因为菌株W1分离自碱性环境,因此在碱性条件下可以更好地发挥去除Cr(Ⅵ)的作用^[23]。

2.2.3 Cr(Ⅵ)浓度对菌株W1还原效果的影响

不同浓度Cr(Ⅵ)对Cr(Ⅵ)去除率影响如图6所示。由图6可知,Cr(Ⅵ)浓度为500~2 500 mg/L的培养基中,菌株W1对Cr(Ⅵ)去除率都在44%以上,其中在1 000 mg/L时,去除率最大,达到68.78%。随着Cr(Ⅵ)浓度的升高,在一定程度上有利于Cr(Ⅵ)的去除,但过高的Cr(Ⅵ)浓度会抑制微生物的生长,甚至会产生毒性和致畸性,导致W1的生长代谢变缓甚至死亡,进而影响其对溶液中Cr(Ⅵ)的去除^[23,26],不过具体菌株去除Cr(Ⅵ)的机制还需进一步的研究。

2.3 EPS与Cr含量分析

胞外聚合物(EPS)对重金属离子具有很好的吸附性能,在不同初始Cr(Ⅵ)浓度条件下,菌株W1产生的EPS量如图7所示。由图7可知,当Cr(Ⅵ)浓度为500 mg/L和1 000 mg/L时,EPS的产生量较高分别为227.27 mg/g和357.14 mg/g,随着铬初始浓度的升高,菌体W1产生的EPS量呈现减少的趋势,该结果与图5中Cr(Ⅵ)的去除率变化趋势相似。此外,当Cr(Ⅵ)浓度为1 000 mg/L时,对产生的EPS化学组分进行了进一步分析,结果如表1所示。由表1可知,菌株表面合成的EPS中蛋白质含量最高,其次是多糖。研究表明,EPS中的蛋白质含量和多糖含量与重金属吸附量存在一定相关性,尤其是蛋白质在重金属吸附中比多糖发挥了更为重要的作用^[27];不仅如此,EPS表面可能含有的负电荷会与重金属发生静电吸附,因此EPS在Cr(Ⅵ)的去除过程中发挥着一定的作用^[15]。

3 结论

(1)本研究筛选分离出一株对铬具有高耐受性的菌株,经过16S rDNA测序和DNA G+C mol%含量测定,可确定菌株W1为假苍白杆菌属。

(2)菌株W1在温度35℃、pH=9.5的条件下生长状况良好,经铬驯化后,在1 000 mg/L Cr(Ⅵ)处理下,56 h内对Cr(Ⅵ)的去除率高达71.54%,其生长曲线呈现出较长的迟缓期,7 h后进入对数生长期,51 h后进入稳定期,故在改良LB培养基中的适宜培养时间为51 h。

(3)驯化后的菌株W1对Cr(Ⅵ)具有较高抗性,在Cr(Ⅵ)浓度为1 500 mg/L时生长达到顶峰,最低抑菌浓度约为2 500 mg/L,高浓度Cr(Ⅵ)(1 500 mg/L以上)会抑制其生长繁殖。

(4)温度、pH和Cr(Ⅵ)浓度均会影响菌株W1对Cr(Ⅵ)的去除效果,其最适去除条件为温度35℃、pH为9.0~10.0,且在Cr(Ⅵ)初始浓度为 1 000 mg/L时,去除率达到最高水平。

(5)在不同浓度Cr(Ⅵ)的条件下,菌株W1产生的EPS含量越高,其对Cr(Ⅵ)的去除率也会越高,这可能与EPS中蛋白质、多糖或者表面负电荷有关。

本研究现阶段仍局限于实验室可控条件下的探索,尚未在实际铬污染场地验证菌株的适应能力与去除效果,也未明确EPS影响Cr(Ⅵ)去除的具体作用方式。后续将结合实际待修复场地的生物与环境条件,进一步开展菌株在真实铬污染环境中的去除效果和EPS机制研究,为修复Cr(Ⅵ)污染环境提供更多可用的菌种资源。

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