现代化工

现代化工 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (4) : 227-232. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.04.037

分析测试

多色荧光细胞成像技术用于ATP与miRNA-21信号放大及同步检测

邹轶 ¹^,² ,
赫晓涛 ² ,
胡婉迪 ² ,
林丽洁 ¹^,² ,
周群舒 ² ,
李修齐 ² ,
卢丹青 ²^,^*

作者信息 +

Multicolor fluorescent cell imaging technology for signal amplification and simultaneous detection of ATP and miRNA-21

ZOU Yi ¹^,² ,
HE Xiao-tao ² ,
HU Wan-di ² ,
LIN Li-jie ¹^,² ,
ZHOU Qun-shu ² ,
LI Xiu-qi ² ,
LU Dan-qing ²^,^*

Author information +

文章历史 +

Received		Published
2025-05-27		2026-04-20
Issue Date	Revised Date
2026-04-16	2025-05-27

PDF (3386K)

摘要

基于氧化石墨烯(GO)的吸附承载能力与杂交链式反应(HCR)的无酶信号放大技术,提出一种多色荧光细胞成像方法,实现了对ATP和miRNA-21的同步检测与信号放大。该方法可在活细胞内对浓度差异达数个数量级的ATP和miRNA-21 2种生物标志物进行检测成像。实验结果表明,ATP和miRNA-21的检测限分别达到0.15 μmol/L和71 pmol/L。本方法有望为相关癌症诊断提供更精准的检测策略。

Abstract

Based on the adsorption capacity of graphene oxide (GO) and the enzyme-free signal amplification technology of hybridization chain reaction (HCR),a multicolor fluorescence cell imaging method is proposed,achieving simultaneous detection and signal amplification of ATP and miRNA-21.This method enables the detection and imaging of two biomarkers,ATP and miRNA-21,with concentration differences spanning several orders of magnitude in living cells.Experimental results show that the detection limits for ATP and miRNA-21 reach 0.15 μmol/L and 71 pmol/L,respectively.This approach holds promise for providing a more precise detection strategy for related cancer diagnosis.

Graphical abstract

关键词

同步检测 / 杂交链式反应 / 氧化石墨烯 / 细胞成像 / 信号放大

Key words

simultaneous detection / hybridization chain reaction / graphene oxide / cell imaging / signal amplification

引用本文

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邹轶,赫晓涛,胡婉迪,林丽洁,周群舒,李修齐,卢丹青. 多色荧光细胞成像技术用于ATP与miRNA-21信号放大及同步检测[J]. , 2026, 46(4): 227-232 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2026.04.037

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微小核糖核酸(miRNA)和三磷酸腺苷(ATP)均为重要的生物标志物。miRNA是内源性非编码RNA分子,由18~23个核苷酸组成,广泛存在于动植物中^[1]。作为蛋白质翻译调控因子,miRNA在多种生物过程中发挥重要作用。ATP是由腺嘌呤、核糖和3个磷酸基团组成的核苷酸,作为生命活动的能量载体存在于所有生物体内^[2]。其在能量代谢中起关键作用,使细胞能够执行各项功能。研究表明,这2种生物标志物的异常浓度与癌症或其他疾病的发生发展密切相关。例如,miRNA-21的异常表达与乳腺癌^[3]、肝癌^[4]和肺癌^[5]等多种癌症相关;ATP异常水平则与恶性肿瘤^[6]、炎症性疾病^[7]以及心脑血管疾病^[8]存在关联。因此,开发快速、灵敏、特异的双标志物检测方法对疾病早期诊断和及时治疗具有重要意义。

目前已有多种生物标志物检测方法被开发。比色法^[9-10]、电化学发光法^[11-12]、荧光法^[13-15]、Northern印迹杂交^[16]、实时定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)^[17]以及寡核苷酸微阵列^[18-19]等技术已用于miRNA检测。然而,单一生物标志物检测易受多种因素干扰导致假阳性。为实现精准医疗,多标志物同步检测方法应运而生。Chon等^[20]通过构建DNA-金纳米粒子可逆网络成功实现血清中双癌症标志物同步检测;Li等^[21]基于杂交链式反应(HCR)和氧化石墨烯(GO)设计了miRNA-21与Let-7a同步检测新策略;Wang等^[22]利用核酸适体与GO实现了ATP与GTP的同时检测。现有方法对表达水平相近的多靶标同源物检测有效,但面对浓度差异显著的生物标志物时存在局限,高浓度标志物易掩盖低表达标志物信号,亟需开发大浓度差异多标志物检测新方法。

本研究基于GO对单链DNA(ssDNA)与双链DNA(dsDNA)吸附承载能力的差异,结合HCR无酶信号放大技术,开发了ATP与miRNA-21同步检测与信号放大的多色荧光细胞成像方法。设计了可被miRNA-21触发进行杂交链式反应的DNA发夹探针对,以及特异性识别ATP的核酸适体。ATP适体与发夹探针末端分别修饰TAMRA和FAM荧光基团,ssDNA探针通过π-π共轭效应吸附于GO表面导致荧光猝灭。利用GO为载体将发夹探针和ATP适体转运至活细胞内,微量miRNA-21即可触发发夹探针HCR形成富含荧光分子的dsDNA,ATP适体则可特异性结合ATP形成复合物。由于dsDNA和ATP复合物无法吸附GO表面,TAMRA与FAM荧光得以恢复。该方法对ATP和miRNA-21的检测限分别达到0.15 μmol/L和71 pmol/L,并在人肝癌细胞(HepG-2)中实现了内源性miRNA-21与ATP的成像分析,证明可成功检测数量级差异显著的双生物标志物。该创新策略有望为癌症早期诊断和精准医疗实施提供新技术方案。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

实验所用寡核苷酸序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成纯化(序列详见表1)。胞苷三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)、尿苷三磷酸(UTP)购自碧云天生物技术有限公司(中国上海),寡霉素购自阿拉丁生化科技股份有限公司(中国上海)。其他试剂均为分析纯,实验用水为超纯水。

1.2 仪器设备

pH测定使用梅特勒-托利多Delta 320型pH计(美国);荧光光谱检测采用日立F4500荧光分光光度计(日本京都);细胞培养使用江苏华美生化HF-S280型CO₂培养箱;共聚焦荧光成像采用奥林巴斯FV100-MPE激光共聚焦成像系统(日本)。

1.3 HCR反应体系构建

将H1、H2与miRNA-21用超纯水配制成100 μmol/L母液,采用SPSC缓冲液(0.75 mol/L NaCl,50 mmol/L Na₂HPO₄,pH 7.4)稀释至20 nmol/L。稀释后的H1、H2经95℃退火5 min后缓慢冷却至室温静置1 h以稳定发夹结构。将H1、H2与不同浓度miRNA-21在SPSC缓冲液中混合(总体积200 μL),室温孵育6 h后加入30 μg/mL GO继续孵育30 min。

1.4 荧光光谱分析

FAM荧光团最佳激发波长(λ_ex)与最大发射波长(λ_em)分别为494、525 nm,TAMRA荧光团λ_ex/λ_em为560 nm/582 nm。荧光光谱扫描激发与发射狭缝宽度均为5.0 nm,分别用于miRNA-21与ATP检测。

1.5 细胞毒性实验

采用CCK-8法评估GO及发夹探针对HepG-2细胞的生物毒性。将细胞悬液接种于96孔板(约 1×10⁶ cells/孔),37℃、5% CO₂/95%空气条件下培养24 h后更换含不同浓度GO的新鲜培养基继续孵育14 h。弃培养基后以10 mmol/L PBS(pH 7.4)洗涤,加入CCK-8染料孵育1 h,于450 nm处测定吸光度(每组6复孔)。采用相同方法评估20 nmol/L发夹探针在不同时间点(0~24 h)的细胞毒性。

1.6 共聚焦荧光成像实验

HepG-2细胞于含10%双抗的DMEM培养基中37℃、5% CO₂培养24 h后接种于24孔板(直径 35 mm),加入GO-探针复合物孵育不同时间后成像。低丰度miRNA-21成像组将HEK-293细胞与GO/H1/H2复合物孵育6 h,PBS洗涤3次后于 λ_ex=488、500~550 nm波段采集荧光信号。ATP成像组细胞与GO/ATP适体/寡霉素或5 mmol/L Ca²⁺混合孵育后于λ_ex=560、570~620 nm波段成像。双标志物同步成像组将HepG-2细胞与ATP适体/GO/H1/H2混合孵育6 h,分别通过FITC通道(FAM)和PE通道(TAMRA)采集荧光信号。

2 结果与讨论

2.1 GO/H1/H2/ATP适体生物传感平台工作原理

如图1所示,本方法基于GO对ssDNA与dsDNA的吸附差异及HCR信号放大技术构建检测体系。设计针对靶标的H1/H2发夹探针对,在H1的3'端与H2的5'端修饰FAM荧光基团,ATP适体5'端修饰TAMRA荧光团。发夹探针与ATP适体共孵育于GO分散液中,ssDNA通过π-π共轭作用吸附于GO表面导致荧光猝灭。以GO为载体将DNA探针转运至细胞内:当存在ATP时,适体特异性结合ATP形成复合物脱离GO表面,TAMRA荧光恢复;当存在miRNA-21时,触发H1/H2发生HCR反应生成富含FAM的dsDNA,因GO对dsDNA吸附力弱而解离,FAM荧光恢复。双标志物共存时,TAMRA与FAM荧光同步恢复,实现ATP与miRNA-21的同步检测。

2.2 HCR反应时间与GO浓度优化

为最大化荧光恢复效率,首先考察miRNA-21检测的HCR反应时间。如图1所示,反应体系荧光强度在6 h达到峰值且不再随时间延长变化,表明GO表面吸附的发夹探针已完全参与HCR反应。故后续实验选择6 h为最佳反应时间。

GO浓度优化实验显示[图2(a)],当GO浓度达30 μg/mL时,ATP适体在582 nm处的荧光强度达到稳定猝灭平台。进一步评估GO对H1/H2的猝灭效果[图2(b)],30 μg/mL GO表现出最佳猝灭效率。探针浓度优化表明[图2(c)],当发夹探针浓度高于20 nmol/L时,525 nm处荧光强度显著升高,提示过量探针无法被GO完全吸附,故选择 20 nmol/L为最优探针浓度。

2.3 生物传感平台体外分析性能

miRNA-21检测分析显示[图3(a)],当miRNA-21浓度从0 nmol/L增至20 nmol/L时,525 nm处荧光强度呈梯度上升。荧光强度与miRNA-21浓度在0~20 nmol/L范围内呈良好线性关系,线性回归方程为F/F₀=0.878 06C_miRNA-21+1.592 2(R²=0.98),检测限达71 pmol/L[图3(b)],其中F为含不同浓度miRNA-21的GO/H1/H2复合物荧光强度,F₀为空白组荧光强度,C为miRNA-21浓度。后续实验进一步评估了该平台对ATP的检测性能。

如图3(c)所示,随着ATP浓度增加,反应体系荧光强度显著增强。当ATP浓度达到3 mmol/L时,荧光强度达到空白对照组的18.4倍。图3(d) 显示,在0.1~1 mmol/L浓度范围内,荧光强度与ATP浓度呈良好线性关系,线性回归方程为F/F₀=11.443 1C_ATP+5.585 4(R²=0.991),检测限为0.15 μmol/L,其中F表示含不同浓度ATP的GO/ATP适体复合物荧光强度,F₀为空白探针荧光强度,C为ATP浓度。上述结果表明,该生物传感平台对ATP与miRNA-21检测具有优异性能。

2.4 ATP与miRNA-21同步检测验证

在PBS缓冲体系中开展双标志物同步检测实验。如图4所示,当体系仅含发夹探针与ATP适体时,荧光信号值极低;加入ATP后,582 nm处可检测到TAMRA荧光恢复;存在miRNA-21时,525 nm处FAM荧光显著增强;当ATP与miRNA-21共存时,582、525 nm处可同时检测到TAMRA、FAM荧光信号。该实验结果证明,本研究设计的生物传感系统可成功实现ATP与miRNA-21的体外同步检测,为细胞内双标志物检测奠定了实验基础。

为验证生物传感平台对miRNA-21与ATP检测的特异性,分别开展干扰物质对比实验。如表2所示,当体系中存在5 nmol/L miRNA-21时,荧光强度显著高于Let-7a、Let-7b和Let-7c(5 mmol/L)等同源物;2 mmol/L ATP引起的荧光强度明显高于其类似物CTP、GTP和UTP(2 mmol/L)。上述结果表明,该生物传感平台对ATP与miRNA-21检测具有良好选择性。

2.5 细胞毒性分析

为评估探针在活细胞中的应用可行性,采用CCK-8法研究GO与发夹探针对HepG-2细胞的毒性。如表3所示,当GO浓度从0增加至100 μg/mL时,细胞存活率始终高于90%。进一步考察 20 nmol/L发夹探针的细胞毒性(表4),不同孵育时间下细胞存活率为93.9%~101.5%,表明发夹探针无明显细胞毒性。

2.6 GO探针负载时间优化

GO的探针运输能力是实现活细胞成像的关键指标。如图5所示,随着孵育时间从0 h延长至 6 h,细胞荧光信号逐渐增强;继续延长孵育时间后荧光强度反而减弱。该结果表明GO具有优良的探针负载能力,且6 h为后续细胞成像实验的最佳孵育时间。

2.7 基于生物传感平台的miRNA-21与ATP活体细胞成像

首先对细胞miRNA-21进行成像分析。选取miRNA-21低表达的正常人肾上皮细胞(HEK-293)与高表达的人肝癌细胞(HepG-2)进行活细胞成像实验。如图6所示,加入GO/H1/H2复合物后,HEK-293细胞未出现明显荧光,表明其miRNA-21表达水平较低;而HepG-2细胞则呈现强烈的FAM荧光信号,说明肝癌细胞中miRNA-21表达水平显著升高。

随后进行细胞ATP成像实验。ATP是细胞活动(尤其是癌细胞)的直接能量来源,因此选择HepG-2细胞作为细胞ATP成像模型。使用寡霉素(ATP抑制剂)和Ca²⁺(ATP促进剂)分别调控ATP水平。如图7所示,当HepG-2细胞与GO/ATP适配体复合物共孵育后,可观察到明显的TAMRA荧光信号;当体系加入寡霉素时,TAMRA荧光显著减弱;而加入Ca²⁺后荧光显著增强。结果表明GO/ATP适配体复合物能够灵敏响应ATP浓度变化,并实现不同浓度ATP的荧光成像。

基于生物传感平台对ATP与miRNA-21的单标志物成像能力,进一步开展HepG-2活细胞内双标志物同步成像研究。如图8所示,在GO/H1/H2/ATP适体复合物作用下,FAM荧光(525 nm)与TAMRA荧光(582 nm)信号同时被激活,表明 miRNA-21与ATP在肝癌活细胞内成功实现共定位可视化检测。该实验结果证实,本平台可突破传统方法对浓度差异显著生物标志物的检测限制,为多维度细胞代谢分析提供了创新方法学工具。

3 结论

本研究基于氧化石墨烯(GO)吸附特性与杂交链式反应(HCR)信号放大技术,开发了一种可同步检测活细胞内ATP与miRNA-21的生物传感平台。体外实验表明,该平台可特异性区分高/低表达量生物标志物,双检测信号互不干扰。通过HepG-2活细胞内源性miRNA-21与ATP成像分析,验证了其在复杂生物环境中的应用潜力。该技术突破了传统方法对浓度差异显著标志物的检测局限,为癌症早期诊断与精准医疗提供了新型双标志物同步检测策略。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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