积雪草不同溶剂提取物的抗氧化活性及其稳定性研究

关富强 ,  彭效明 ,  居瑞军 ,  杨思敏 ,  严晓强 ,  管洁

现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (3) : 100 -105.

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现代化工 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (3) : 100-105. DOI: 10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.03.019
科研与开发

积雪草不同溶剂提取物的抗氧化活性及其稳定性研究

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Study on antioxidant activity and stability of Centella asiatica extracts over different solvents

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摘要

利用不同质量分数的乙醇以及水作为溶剂,系统比较了不同溶剂提取物中多酚的质量分数及其对DPPH和ABTS自由基的清除能力。结果表明,80%乙醇提取物中多酚质量分数最高(9.28 mg/g),其抗氧化活性在所有溶剂中表现最佳,DPPH清除率高达96.23%,ABTS清除率达95.28%,表明多酚质量分数与抗氧化能力之间存在强正相关。此外,探讨了光照、温度、pH和特定化学物质对多酚稳定性的影响,结果发现高温和强光照显著降低多酚稳定性,而适宜的酸性环境可显著提高其稳定性。同时优化了积雪草多酚的提取条件,为其在医药和化妆品行业中的应用提供了新的科学依据。

Abstract

The mass fractions of polyphenols in the extracts from Centella asiatica by different solvents that contain ethanol and water with varying mass fractions from 20% to 95%,and their scavenging abilities against DPPH and ABTS free radicals are systematically compared.Results show that the extract by 80% ethanol has the highest polyphenol mass fraction (9.28 mg·g-1),and the best antioxidant activity.The clearance rates of DPPH and ABTS by it are as high as 96.23% and 95.28%,respectively,which also indicates there is a strong positive correlation between polyphenols content and antioxidant capacity.In addition,the impacts of illumination,temperature,pH and specific chemicals on the stability of polyphenols are explored.It is found that high temperature and strong illumination can significantly reduce the stability of polyphenols,while a suitable acidic environment can significantly improve its stability.The conditions for the extraction of polyphenols from Centella asiatica are optimized,providing new scientific basis for the application of Centella asiatica polyphenols in the pharmaceutical and cosmetics industries.

Graphical abstract

关键词

积雪草 / 稳定性 / 抗氧化 / 极性部位 / 多酚

Key words

Centella asiatica / stability / antioxidant / polar parts / polyphenols

Author summay

关富强(1998-),男,硕士生,研究方向为天然产物研究与开发,

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关富强,彭效明,居瑞军,杨思敏,严晓强,管洁. 积雪草不同溶剂提取物的抗氧化活性及其稳定性研究[J]. , 2025, 45(3): 100-105 DOI:10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2025.03.019

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积雪草(Centella asiatica)也称崩大碗、落得打或雷公根,是伞形科植物的干燥全草。其药用历史悠久,味苦、辛、性寒,主要用于治疗湿热黄疸、跌打损伤以及慢性肾脏病和糖尿肾脏病等多种病症[1-2]。此外,积雪草的抗肿瘤活性也得到学术界的关注[3]。积雪草分布极为广泛,主要生长在海拔200~1 900 m的热带和亚热带地区,如中国的江西、湖南、湖北、广西、四川和云南等地。
积雪草中富含三萜类化合物和黄酮类以及挥发油、多糖和多酚等多种成分,具有显著的抗氧化、降血糖、抗炎及抗肿瘤活性[4-8]。其中,积雪草苷和羟基积雪草苷因其在美白产品中的应用而被广泛研究,这些化合物调控酪氨酸酶的mRNA,影响黑色素生成,展现出明显的美白效果[9]。羟基积雪草苷还能激活细胞自噬、降低丙二醛含量、提高SOD活性、有效抑制脂质过氧化[10-11]。研究发现,积雪草的抗氧化、细胞毒性、抗菌和溶栓活性与其富含的酚类物质和类黄酮紧密相关。实验表明,类黄酮含量与总抗氧化活性之间存在显著相关性。此外,积雪草的乙醇提取物中的总酚含量及其抗氧化剂和抗菌活性也被广泛评估,揭示了其潜在的健康益处[12-14]
尽管积雪草的多种生物活性已得到广泛研究,但针对其活性成分特别是多酚类化合物的系统提取和稳定性评估的研究仍较少。笔者利用不同极性的溶剂(水及20%~95%的乙醇)探索积雪草多酚的最优提取效率,并分析这些提取物的抗氧化能力及其稳定性。

1 实验仪器与材料

1.1 仪器与设备

KQ-500E型超声波清洗器,昆山禾创超声有限公司生产;SLXFATS型酶标仪,美国伯腾仪器有限公司生产;SCIENTZ-50F型冷冻干燥机,宁波新芝生物股份有限公司生产;SHZ-95B型循环水式多用真空泵,天津科诺仪器设备有限公司生产;R-1005型旋转蒸发仪、低温冷却液循环泵,郑州长城科工贸有限公司生产。

1.2 材料与试剂

积雪草药材,产地贵州;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,美国Sigma公司生产;过硫酸钾,北京耦合科技有限公司生产;三氯乙酸,上海麦克林生化科技有限公司生产;甲醇,北京伊诺凯科技有限公司生产;抗坏血酸,山东西亚股份有限公司生产;铁氰化钾、三氯化铁,上海阿拉丁试剂有限公司生产;乙醇,北京化工厂有限责任公司生产;过氧化氢,国药集团化学试剂有限公司生产;Na2SO3,天津市福晨化学试剂厂生产;无水碳酸钠、福林酚、磷酸缓冲液、蔗糖,大连美仑生物技术有限公司生产;氢氧化钠,北京化工厂生产;氯化钙,北京现代东方精细化学品有限公司生产;氯化钠、柠檬酸钠,天津市光复科技发展有限公司生产。

2 实验方法

2.1 积雪草不同溶剂提取物的制备

首先将积雪草粉末粉碎至60目,接着用不同极性溶剂(水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇)对积雪草活性成分进行提取,按照1∶15的料液比加入不同极性的浸提溶剂,超声1 h,抽滤取上清液,残渣循环提取1次,再经浓缩、干燥得到积雪草不同溶剂提取物。

2.2 多酚标准曲线的绘制

称取没食子酸标准品,采用福林酚比色法配制成200 mg/mL的没食子酸储备液,备用,取储备液稀释成一系列质量浓度的标准溶液,分别取上述标准液100、250 μL福林酚试剂加入1 mL容器中,在室温下充分反应5 min,再加入15% Na2CO3溶液250 μL,定容至刻度线,摇匀。在40℃下恒温水浴60 min,取出在室温下冷却静置20 min,取3个平行孔,在778 nm测定吸光值[15],绘制了以吸光值为纵轴、浓度为横轴的多酚含量-浓度标准曲线。
积雪草多酚含量的测定:取制备好的积雪草样品配制成2 mg/mL的溶液,稀释一定的倍数,按上述测定方法检测。

2.3 体外抗氧化活性的测定

2.3.1 清除DPPH活性的测定

称取DPPH置于容量瓶中,加入甲醇配制浓度为1 mmol/L的DPPH储液,避光备用;配制4 mg/mL不同提取物溶液,并对半稀释到0.125 mg/mL,备用。
取不同提取物的样品溶液0.2 mL,再加入0.6 mL DPPH储液,以纯水作为空白对照;混合均匀后在室温下避光放置反应30 min,5 000 r/min离心2 min,同时将DPPH储液替换成甲醇溶液作为对照组。取0.2 mL制作3个平行复孔,在540 nm处测定吸光值。DPPH清除率计算式为:
= [ 1 - ( A - A ) / A ] × 100 %

2.3.2 清除ABTS活性的测定

称取ABTS和过硫酸钾用纯化水配制成溶液,各取250 μL混合,避光6 h后用PBS稀释35倍,即为ABTS储备液。
准确称取10 μL积雪草提取物样品溶液,加入200 μL ABTS储备液为样品组;依次准确吸取10 μL纯水、200 μL PBS工作液作为样品对照组;依次准确吸取10 μL Vc溶液、200 μL ABTS储备液作为阳性对照组;依次准确吸取10 μL PBS、200 μL ABTS储备液作为空白组;每组设置3个平行,在540 nm处测定所有样品组吸光值[16]。ABTS清除率计算式为:
A B T S = [ 1 - ( A - A ) / A ] × 100 %

2.3.3 总还原力的测定

用纯水配制成0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL及4 mg/mL的提取物溶液和Vc标准液。在离心管中依次加入样品溶液、磷酸缓冲溶液、铁氰化钾溶液,震荡摇匀,放入水浴锅中50℃恒温水浴20 min,取出冷却。再加入10%三氯乙酸溶液,离心后取上清液,向其中加入无水乙醇和0.1%三氯化铁,摇匀,在波长为700 nm处测吸光值[17]

2.4 积雪草多酚的稳定性

2.4.1 光照对积雪草多酚稳定性的影响

配制相同质量浓度的积雪草乙醇水溶液,将其暴露于阳光和阴暗处放置,一定时间后取样,计算多酚保留率,探究光照和黑暗对积雪草多酚稳定性的影响[18]

2.4.2 温度对积雪草多酚稳定性的影响

配制一定浓度的积雪草乙醇水溶液,分别置于不同温度下恒温水浴,分别放置一定时间后取样,计算多酚保留率,探究温度对积雪草多酚稳定性的影响[19]

2.4.3 pH对积雪草多酚稳定性的影响

配制一定浓度的积雪草乙醇水溶液,调节不同pH,室温下静置30.0 min,取样,计算多酚保留率,探究pH对积雪草多酚稳定性的影响[20]

2.4.4 氧化物、还原物对积雪草多酚稳定性的影响

配制一定浓度的积雪草乙醇水溶液,分别加入适量不同浓度的Na2SO3和H2O2溶液,摇匀后静置30.0 min,取样,计算多酚保留率,探究氧化物、还原物对积雪草稳定性的影响[21]

2.4.5 金属离子对积雪草多酚稳定性的影响

向积雪草乙醇水溶液中加入不同质量浓度的FeCl3、NaCl、CaCl2溶液,将含有金属离子的积雪草乙醇水溶液静置30.0 min,取样,探究金属离子对积雪草多酚稳定性的影响。

2.4.6 食品添加剂对积雪草多酚稳定性的影响

柠檬酸钠和蔗糖等都属于食品调味剂[19],将不同质量浓度的柠檬酸钠和蔗糖加入到积雪草配制的乙醇水溶液中,静置6.0 h,探究柠檬酸钠和蔗糖对积雪草多酚稳定性的影响。

2.5 数据统计分析

所有实验均至少重复进行3次,取平均值,运用Excel和SPSS软件对其数据进行处理,用相关分析对不同溶剂提取物的多酚含量和抗氧化活性进行比较。

3 结果与分析

3.1 不同溶剂提取物中多酚质量分数的测定

积雪草不同溶剂提取物的多酚质量分数如表1所示。
表1中可以看出,不同极性溶剂积雪草提取物的多酚质量分数显示出显著差异。多酚质量分数随乙醇质量分数的增加总体呈现上升趋势,其中80%乙醇提取的多酚质量分数最高,达到9.28 mg/g,而纯水提取的多酚质量分数最低,仅为0.57 mg/g。表明存在一个最优的乙醇质量分数可最大化地提取多酚。

3.2 不同极性溶剂提取物清除自由基的能力

3.2.1 DPPH自由基的清除能力

积雪草不同溶剂提取物对DPPH自由基清除率的影响如图1所示。
图1中可以看出,积雪草不同提取物的DPPH自由基清除效率随质量分数的增加而提高。80%乙醇积雪草提取物中多酚质量分数最高(9.28 mg/g),且在体外抗氧化活性测试中表现最佳,特别是在0.125~4 mg/mL的质量浓度范围内,80%乙醇提取物展示了最高的抗氧化效率,清除率从28.35%增至96.23%。表明多酚质量分数与抗氧化活性之间存在直接的正相关性,各提取物DPPH自由基的清除能力由低到高的顺序分别为20%乙醇<水<40%乙醇<60%乙醇<95%乙醇<80%乙醇。

3.2.2 ABTS自由基的清除能力

积雪草不同溶剂提取物对ABTS自由基清除率的影响如图2所示。
图2可知,随着积雪草提取物质量分数的增大,对ABTS自由基的清除能力逐渐升高,其中80%乙醇提取物的抗氧化活性最强,其清除能力整体低于Vc对照组,但优于其他提取物。当质量浓度为 4 mg/mL时,80%乙醇对ABTS自由基的清除率达到95.28%。所有不同极性部位提取物抗氧化活性与质量分数之间呈现一定的线性关系,对ABTS自由基的清除能力由低到高依次为水<20%乙醇<40%乙醇<95%乙醇<60%乙醇<80%乙醇。

3.2.3 总还原力清除能力

在0.125~4 mg/mL质量浓度范围内积雪草的总还原力如图3所示。
图3中可以看出,随着样品溶液质量浓度的增加,吸光度也随之增强,吸光度越高说明抗氧化剂总还原能力越强,表明积雪草的不同溶剂提取物都具有一定的还原能力,6种不同溶剂提取物的总还原能力由小到大分别为水<20%乙醇<40%乙醇<60%乙醇<95%乙醇<80%乙醇。

3.3 积雪草多酚的稳定性结果

3.3.1 光照对积雪草多酚稳定性的影响

光照对积雪草多酚稳定性的影响如表2所示。
表2可知,在避光条件下,积雪草多酚的质量分数下降较为缓慢,表明其稳定性较好,而在光照条件下下降明显,在光照72 h后多酚的保留率只有43.30%。说明在避光条件下,积雪草多酚的稳定性较高,在光照条件下积雪草多酚中的光敏性物质结构遭到破坏,从而导致稳定性变差。实验结果表明,积雪草多酚在储存时需避免光照,以保持其稳定性。

3.3.2 温度对积雪草多酚稳定性的影响

温度对积雪草多酚稳定性的影响如表3所示。
表3可知,温度为20~40℃,积雪草多酚的质量分数比较稳定,当温度大于40℃低于80℃时,出现了小幅度上升;当温度高于80℃时,积雪草多酚因温度过高受热分解,产生更多的酚羟基,从而吸光值出现上升趋势。所以积雪草多酚在提取、保存时温度都应该保持在40℃以下为宜。随着时间的延长,多酚的质量分数出现明显下降,说明多酚长时间处在高温环境中不太稳定。

3.3.3 pH对积雪草多酚稳定性的影响

pH对积雪草多酚稳定性的影响如表4所示。
表4可知,多酚稳定性随着pH的增大逐渐变差,多酚保留率降低。在酸性环境中积雪草多酚可以保持很好的稳定性,这是由于多酚结构中含有大量的酚羟基,在酸性条件下其结构较为稳定,而在碱性环境中,酚类物质易氧化为醌类物质,导致稳定性变差[22-23],积雪草多酚在pH≤6的条件下较为稳定,多酚保留率在80%以上。

3.3.4 氧化物、还原物对积雪草多酚稳定性的影响

氧化物、还原物对积雪草多酚稳定性的影响如表5所示。
表5可知,Na2SO3和H2O2对积雪草多酚的稳定性有很大的影响,随着Na2SO3和H2O2质量分数的增大,使得积雪草多酚的结构破坏,含量明显下降;在相同质量分数作用于积雪草多酚时,H2O2对积雪草多酚的破坏作用较大,当Na2SO3和H2O2质量分数为0.05%时,积雪草多酚的保留率分别为84.32%和78.11%。所以在生产、储存和运输过程中应避免与氧化剂和还原剂接触。

3.3.5 金属离子对积雪草多酚稳定性的影响

金属离子对积雪草多酚稳定性的影响如表6所示。
表6中可以看出,不同金属离子对积雪草多酚的影响大小依次为Fe3+>Na+>Ca2+,Na+和Ca2+对积雪草多酚的影响略小于Fe3+,当Fe3+质量分数达到0.05%时,积雪草多酚质量分数下降17.75%,这是由于积雪草多酚的酚羟基与金属离子之间形成配位键形成金属离子-多酚络合物,改变了多酚结构,从而导致积雪草多酚的稳定性和活性下降。

3.3.6 食品添加剂对积雪草多酚稳定性的影响

食品添加剂对积雪草多酚稳定性的影响如表7所示。
表7可知,随着食品添加剂柠檬酸钠和蔗糖质量分数的升高,蔗糖对多酚保留率的影响很小,几乎没有变化,说明蔗糖对积雪草多酚的稳定性没有什么影响;而柠檬酸钠随着质量分数的升高,积雪草多酚的保留率出现下降,当柠檬酸钠质量分数为0.05%时,多酚的保留率只有77.33%。

3.4 积雪草多酚含量与清除自由基的相关性分析

通过SPSS软件对积雪草不同提取物的抗氧化能力进行定量分析,计算了IC50值,即在体外试验中抑制50%的自由基所需的提取物浓度。IC50值较低表示抗氧化能力较强。同时,总还原力以吸光度0.5对应的浓度来表示。不同溶剂提取物IC50值如表8所示。
表8中可以看出,80%乙醇提取物在抗氧化性能评估中表现最为突出,其IC50值在所有溶剂中最低,表明该质量分数的乙醇溶剂不仅有效地提取了积雪草中的多酚类化合物,而且这些多酚具有较强的抗氧化能力。相比之下,40%乙醇和水提取物在总还原力测试中表现较弱,尤其是水提取物的总还原力IC50值最高,达到10.00 mg/mL,说明其抗氧化能力相对较低。然而,尽管这2种溶剂在总还原力上表现不佳,其在清除DPPH和ABTS自由基的测试中效果相对较好。表明积雪草提取物中除多酚外,还包含其他抗氧化成分,这些成分对不同类型的自由基展现出选择性的清除作用。
积雪草各提取物多酚含量与清除自由基的相关性如表9所示。
表9中可以看出,不同溶剂提取的积雪草多酚质量分数与清除DPPH、ABTS自由基和总还原力具有相关性。具体来说,多酚质量分数与清除DPPH自由基能力之间存在非常强的正相关(相关系数为0.981,P<0.01),而与清除ABTS自由基和总还原能力的相关系数分别为0.914和0.881,均在0.05的显著性水平上表现出显著的正相关。表明多酚成分在提升积雪草提取物的抗氧化效果中的核心作用,为其在健康食品和药物开发中的潜在应用提供了坚实的科学基础。

4 结论

通过用不同极性溶剂从积雪草中提取多酚并评估其抗氧化能力,揭示了溶剂类型对多酚提取效率和提取物抗氧化性能的显著影响。结果表明:
(1)80%乙醇作为提取溶剂时,所得提取物中的多酚质量分数最高(9.28 mg/g),并在抗氧化活性测试中显示出最优异的性能,证实多酚质量分数与提取物的抗氧化活性之间存在直接的正相关性。
(2)多酚的稳定性研究表明,环境因素如光照、温度、pH及某些化学物质(如金属离子和食品添加剂)显著影响多酚的化学稳定性。特别是高温和强光照均会显著降低多酚的稳定性,而适宜的酸性环境(pH≤6)有助于维持多酚的稳定性。
(3)该研究为积雪草多酚的有效提取和稳定性控制提供了重要的科学依据,并为积雪草多酚在药品、食品和化妆品工业中的应用开发奠定了基础,推动了天然植物资源的有效利用和产业化发展,有望在未来促进积雪草的更广泛应用。

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基金资助

国家自然科学基金项目(21406015)

北京市教委科技计划一般项目(KM202210017011)

北京市教委科技计划一般项目(KM202310017009)

北京石油化工学院校内学科平台建设项目(2019XK006)

北京石油化工学院交叉科研探索项目(BIPTCSF-2023008)

北京石油化工学院致远科研基金(2023013)

北京市科协青年人才托举工程项目(BYESS2023259)

大学生创新创业训练计划项目(2024J00293)

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